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  • 【论文】 寨卡病毒microRNA靶向减毒疫苗株的构建与鉴定

    作者:解东洋 关键词:microRNA ; 寨卡病毒 ; 反向遗传学技术 ; 感染性克隆 ; 减毒活疫苗 机构:安徽医科大学 ; 安徽医科大学 年份:2018
    摘要:寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)属黄病毒科黄病毒属,单股正链RNA病毒,直径约50 nm,基因组大小约为10.7Kb。寨卡病毒病是由寨卡病毒引起的一种蚊媒病毒病,主要通过伊蚊进行传播。2015年以后,拉丁美洲寨卡病毒病暴发,同时伴随大量新生儿出现小头症。2016年2月1日,世界卫生组织(WHO)将其列为值得全球关注的公共卫生危机。目前,国内外尚无有效的疫苗和药物可以预防和治疗寨卡病毒病,所以迫切需要研发寨卡病毒疫苗。减毒活疫苗是目前使用的疫苗类型之一,它可以全面激活体液和细胞免疫应答反应,使机体获得更广泛持久的免疫保护。近年来,microRNA(miRNA)介导的靶向减毒策略在病毒疫苗研究领域中取得了突破性进展,其主要机制是利用组织细胞内特异的miRNA能够控制病毒组织嗜性,借此降低或消除病毒在特定组织的增殖和致病效应。这一策略能保留病毒免疫原性,又可降低病毒致病性,为研制新型减毒活疫苗提供了全新的手段。现已确认,寨卡病毒感染能够导致胚胎脑中神经干细胞的增殖与分化异常,造成神经元大量死亡,引起小头症。因此,如果能够抑制寨卡病毒在胚胎脑组织中的复制,则有可能大大降低寨卡病毒感染导致小头症的发生风险。本研究中,首先通过反向遗传学技术构建携带有脑组织特异miRNA靶序列的寨卡病毒全长感染性cDNA克隆;然后拯救携带有miRNA靶序列的寨卡重组病毒并鉴定生物学特征;最后在动物模型上评价该重组病毒的免疫原性和保护效果,为下一步寨卡病毒减毒活体疫苗的研制奠定基础。一、寨卡病毒microRNA靶向减毒疫苗株的构建与鉴定基于特异性miRNA在相关组织器官中的作用原理作为减毒机制,对寨卡减毒株的构建进行了合理设计。将脑组织特异性的mi RT-9、miRT-124和miRT-125靶序列的单拷贝和三拷贝分别插入寨卡病毒基因组的3’URT序列前端10379bp处,利用反向遗传学技术拯救重组病毒。拯救的重组病毒进一步通过蚀斑、生长曲线、IFA、结构预测、遗传稳定性、RNA mimics体外干扰及动物实验等方法对其生物学特征进行鉴定。结果表明:重组病毒蚀斑略小于亲本株,能够在BHK-21、C6/36、Vero细胞系中高效复制,并且能够高效表达病毒特异E蛋白;结构预测和序列分析发现,除miRT-125*3重组病毒株二级结构不稳定,并且其第6代序列发生突变外,其余5株均结构稳定,能够稳定遗传;RNA mimics体外干扰能够抑制miRT-124*3重组病毒株复制能力,同时重组病毒在小鼠脑组织中的复制受限,这说明miRNA的确能够调控重组病毒增殖;更重要的是,重组病毒的乳鼠神经毒力只为亲本株的1/10,毒力显著降低。二、寨卡病毒microRNA靶向减毒疫苗株的免疫原性与保护评价根据第一部分实验结果,我们在6种重组病毒中选择了神经毒力较弱的miRT-124*3减毒株,利用建立的小鼠和孕鼠保护模型进一步评价其免疫原性和免疫保护效果。实验结果表明,免疫成鼠后miRT-124*3重组病毒株能够诱导小鼠产生较高的中和抗体,显著降低产生的病毒血症,具有较好的免疫原性;免疫母鼠后,能够对母鼠起到完全保护,无病毒血症现象出现,同时,在胎盘和胎头中也检测不到病毒,能够保护胚胎发育。这说明miRT-124*3重组病毒株不仅可以有效保护成鼠,而且可以保护孕鼠和胎鼠。综上,本研究以寨卡病毒株的感染性克隆为骨架,通过反向遗传学技术成功构建并获得携带有脑组织特异性miRNA靶序列的寨卡重组株。该重组病毒能够在体外细胞水平稳定复制,并在小鼠动物模型上充分表现出了明显的减毒特征,同时该病毒具有较好的免疫原性,能够对免疫小鼠和孕鼠起到较好的保护作用。
  • 【论文】 虎皮鹦鹉性腺microRNA组的高通量测序与分析

    作者:蒋澜 关键词:microRNA ; 虎皮鹦鹉 ; 鹦形目 ; 高通量测序 机构:安徽师范大学 ; 安徽师范大学 年份:2016
    摘要:动物、植物和病毒中发现多种micro RNA,每个micro RNA能够靶定成百上千种m RNA的不同位置,从而进行不同的上调下调功能。动物micro RNA功能如发育时间、神经元细胞命运、细胞增殖与分化、新陈代谢与衰老、细胞凋亡与器官形态发生都揭示micro RNA在调控动物个体出生与死亡有着尤其重要的作用。micro RNA在植物、哺乳动物、人中研究甚多,然而,在鸟类中的研究尚少,为了丰富鸟类中的micro RNA数据集,采用成体虎皮鹦鹉的卵巢(n=3)和精巢(n=3)提取总RNA,构建两个小RNA库,用高通量测序仪Hiseq 2500单道测序获取数据。基于以上实验数据拟解决如下科学问题:(1)虎皮鹦鹉micro RNA组的基本数据信息;(2)虎皮鹦鹉性腺micro RNA数据的比较分析;(3)筛选虎皮鹦鹉性腺micro RNA的差异表达信息;(4)micro RNA有无系统进化意义。主要的研究结果如下:1.小RNA序列文库的分析卵巢原始数据9,191,836和精巢原始数据6,383,927,经过接头去除、质量控制、片段长度筛选,保留有卵巢82.03%去除接头以及一些质量值较低的数据(clean reads)和精巢84.43%clean reads。最后,卵巢7,540,057序列中572,201 unique reads和精巢5,389,781序列中2,370,340 unique reads用来进行后续分析。2.新micro RNA的识别本研究中,我们预测了151个pre-mi RNAs,其中142个pre-mi RNAs编码了92个micro RNA家族,一共包括211个新的micro RNA(known)。211个新micro RNA(known)中有13个编码保守的micro RNA,仅仅在鸟类中出现,或首次在鸟类发现(现有数据中,其他鸟类没有,在其他物种中保守的已知micro RNA)。其他micro RNA不仅在鸟类,也在其他物种中发现。3.micro RNA家族在GGU基序和必需调控因子中的功能分析在本研究所有预测的micro RNA中,我们发现有77个micro RNA在GGU基序中的U位置发生变化,这很可能改变micro RNA的特异性靶标,从而对与之相关的细胞过程和基因表达产生更深层次的影响。GGU基序位于种子序列内部,本研究中77条micro RNA中有17条序列的种子序列不含GGU基序,GGU基序位于种子序列之外。发现mi R-9家族和mi R-140家族保守存在于虎皮鹦鹉micro RNA组中,大大丰富了鸟类发声学习领域的micro RNA数据支持。4.鸟类特有mi R-2954基因的q PCR验证及功能分析mi R-2954是鸟类中特有的micro RNA,且在雄性中的表达高于雌性,在鸡和珍珠鸟中都有发现且在雄性中高度表达。同时,我们通过随机取样进行q PCR验证生物信息学分析。mi R-2954的靶标基因会编码一个TLE4转录因子家族蛋白,包含了Ca MKIV、SCAMP1和SCAMP2可能与神经系统的某些特殊功能相关。在KEGG分析中,Mun-mi R-2954与发育、环境适应、神经系统、信号分子和互作都有关联。这些结果将提供很多有用信息用于今后的进一步研究。5.精巢、卵巢组织中显著差异表达的micro RNA筛选及进化分析本研究中,252个新的micro RNA共筛选得到17个显著差异表达micro RNA。其中Mun-novel6-3p、Mun-novel31-5p、Mun-mi R-1626-5p、Mun-mi R-215-5p和Mun-mi R-2954a-3p尤为显著表达。抽取Mun-mi R215-5p进行q PCR验证,基于前体结构对脊椎动物现有mi R-215的前体数据进行系统进化分析,发现pre-mi RNA在系统进化中的意义。本实验提供252个micro RNA前体数据,可用于后续进化分析研究。综上所述,本研究首次报道了虎皮鹦鹉micro RNA组原始数据,预测了211个新的micro RNA(known)和41个具有在生理和功能表达方面具有特异性调控功能的新micro RNA(novel)。此外,我们随机验证了一些在卵巢和睾丸中差异性表达的micro RNA(Mun-mi R-18b-5p,Mun-mi R-2954a-3p,Mun-mi R-215-5p,Mun-novel10-5p,Mun-novel24-3p)。mi RNA已成为强有力的调控分子,我们通过分析发现,某些mi RNA能够影响性别差异性表达。经过生物信息分析构建的两个小RNA文库自身的数据特征和q PCR随机验证,表明本研究构建的文库质量合格且数据真实可靠,这为进一步分析生物在性别特异性差异方面的生物机制和功能研究奠定了基础,也可用于进一步研究。
  • 【论文】 鮸鱼鳗弧菌感染相关microRNA的鉴定及分析

    作者:许国良 关键词:MicroRNA ; 鮸鱼 ; 反义miRNA转录本 ; 免疫调控 机构:浙江海洋大学 ; 浙江海洋大学 年份:2016
    摘要:鮸鱼(Miichthys miiuy)是一种具有重要经济价值的海洋水产鱼类,属于石首科,主要分布在太平洋西北部:从日本海西部到中国东海区域。近年来,鮸鱼被广泛养殖,但是,其养殖规模一直受到许多病原菌和寄生虫带来的各种感染性疾病所限制。目前,基于鮸鱼转录组和EST测序数据,许多免疫相关基因已展开研究。MicroRNA(miRNA)是一大类内生非编码小分子RNA(small RNA,sRNA),它能够通过不完全互补配对形式靶作用于信使RNA(mRNA),并可在转录后水平上通过抑制mRNA翻译或者诱导mRNA降解的方式调控各种生理过程。研究表明miRNA在宿主对抗各种病原体感染过程中起到关键作用。作为一种革兰氏阴性,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是鮸鱼养殖过程中一种常见的病原菌。为了鉴定在鳗弧菌侵染时起到免疫调控作用的mi RNA,我们对健康的鮸鱼和受鳗弧菌侵染的鮸鱼的脾脏组织进行了sRNA转录组测序。本研究通过sRNA转录组测序,得到的主要结论如下:1.构建了两个sRNA文库并通过Illumina高通量测序平台进行测序。经过低质量序列的过滤,在对照组(control group,CG)与感染组(infected group,IG)文库中分别获得了12,052,153和11,150,433条clean reads。基于鮸鱼基因组序列,鉴定了241个保守的和137个novel miRNA前体,分别编码293个和124个成熟的miRNA。2.分析了分布在正义转录本上的233个保守miRNA的家族分类,其中229个mi RNA归类于91个基因家族,另外4个miRNA(mmi-miR-2184-1,mmi-miR-2184-2,mmi-miR-8159,mmi-miR-8161)未归类到任何家族。80.7%(188)的保守miRNA基因归属于50个mi RNA家族,这些家族在鮸鱼基因组中至少由两个成员组成,其中最大的两个家族是let-7和mir-10,它们分别包含19和11个旁系同源基因。为了研究这些基因家族的进化保守性,我们把这91个保守的miRNA家族,根据这些mi RNA基因在动物界的分布,分成6大类。miRNA基因家族进化分析结果显示,mi RNA在脊椎动物起源初期发生过一次数量的大爆发,并且当一个基因家族在一个支系中产生后就很少再次缺失。3.鉴定了10个反义起源的miRNA,其中8个(mmi-antisense-miR-100-1,miR-100-2,mi R-16-1,miR-193,miR-21-1,mi R-181a-3,let-7a-1 and let-7b-1)来源于保守miRNA基因位点。尽管miR-100基因位点的正义链与反义链都表达,但是两个miRNA的5p成熟体的“种子序列”不同。因此。反义mi RNA转录本是新miRNA起源的途径之一。4.通过这两个库的数据比对,发现了12个显著差异表达的miRNA。与CG库相比,其中6个miRNA是表达上调的,另外6个是表达下调的。我们进一步对6个miRNAs(mmi-mi R-122,mmi-miR-143,mmi-miR-455,mmi-miR-192,mmi-miR-375,mmi-miR-3570)进行了实时荧光定量PCR验证。尽管测序结果与荧光定量结果间倍数变化存在差异,但是它们的变化趋势是一致的。实时荧光定量PCR验证结果说明我们的高通量测序数据是可信的,能够揭示免疫相关miRNA的表达变化。5.对12个差异表达的miRNA进行了靶基因预测和功能分析,结果显示这些mi RNA参与多条免疫相关信号通路的调控。这些差异表达的mi RNA能够通过转录后调控TLRs(Toll-Like Receptors,TLRs)或者TLR相关信号通路蛋白的表达,进而激活TLR信号通路的多个转录因子,如AP-1、IRF5、NF-κB和IRF3,这些转录因子能够引起有效的宿主免疫反应来清除感染的病原体。本研究对鳗弧菌感染前后的鮸鱼miRNA进行鉴定和特征分析。miRNA表达量和差异表达mi RNA靶基因和功能预测综合分析,有助于理解当宿主与病原体相互作用时mi RNA在鱼类中的调控机制。
  • 【期刊】 microRNA与口腔鳞状细胞癌的研究新进展

    刊名:临床与病理杂志 作者:汤伟伟 ; 祝常青 ; 何永文 关键词:MICRORNA ; 口腔鳞状细胞癌 ; 诊断靶向治疗 机构:[1]昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科 ; [1]昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科 ; [2]昆明医科大学基础医学院病理教研室 年份:2018
    摘要:microRNA即miRNA,又被称为微小RNA,是一组由18~24个核苷酸长度组成的内源性非编码单链RNA,研究发现miRNA在包括口腔鳞状细胞癌在内的恶性肿瘤的发生发展中起重要的调控作用。以miRNA为靶标的靶向治疗受到人们的关注,针对miRNA的研究或许能为口腔鳞状细胞癌的治疗找到新的策略。
  • 【期刊】 细粒棘球绦虫原头蚴microRNA表达谱分析

    刊名:畜牧兽医学报 作者:王正荣 ; 薄新文 ; 张艳艳 ; 马勋 ; 卢平萍 ; 徐梦飞 ; 孟季蒙 关键词:microRNA ; 细粒棘球绦虫 ; 原头蚴 ; 表达谱 机构:新疆农垦科学院畜牧兽医研究所省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室 ; 新疆农垦科学院畜牧兽医研究所省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室 ; 石河子大学动物科技学院 年份:2018
    摘要:旨在解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴miRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,本研究从细粒棘球绦虫原头蚴中分离得到109个已知的miRNA分子,同时得到189个新的miRNA发夹前体分子。靶基因的预测结果显示,已知miRNA共有132个靶基因,而新发现的miRNA共有3 152个靶基因。进一步的研究发现这些miRNA分子广泛参与虫体生长发育相关的关键信号通路,诸如wnt、cAMP、Hedgehog、NF-κB、Notch以及胆酸盐等信号通路,研究又进一步采用实时荧光定量PCR以及原位杂交技术对虫体经典wnt信号通路相关的miRNA分子以及其靶标基因进行了差异表达以及组织定位研究。结果提示,HG328413.1_36258和β-catenin、HG328414.1_36364*和dis以及HG328399.1_25846和axin可能存在潜在的调控关系。综上所述,本研究在细粒棘球绦虫原头蚴中发现了大量的新的miRNA分子,丰富了原头蚴miRNA的数据,为进一步解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。
  • 【论文】 骨质疏松症患者血浆外泌体microRNA标志物的筛选

    作者:杜昱和 关键词:microRNA ; 外泌体 ; 骨质疏松症 ; 标志物 机构:延安大学 ; 延安大学 年份:2018
    摘要:目的:筛选出反映骨质疏松症(osteoporosis,OP)发生发展的血浆外泌体(exosomes)microRNA的标志物,作为早期预测骨质疏松症的实验室检查手段之一,为临床医生提供骨质疏松症诊断及防治的新思路。方法:收集西安市中心医院内分泌科2016年1月至2017年10月门诊及住院患者为研究对象,排除以下情况:内分泌及代谢性疾病、自身免疫性疾病、长期服用影响骨代谢的药物者、胃肠道手术史、肝肾功能不全、恶性血液疾病、遗传性疾病、孕妇、准备妊娠、哺乳期妇女、血压控制不良、严重心脏病、慢性缺氧性疾病、应激情况、全身一般状况较差、年龄<40岁及>76岁以上。骨质疏松症的诊断标准采用2011年中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志发布的《原发性骨质疏松症诊疗指南(2011)》实行:骨质疏松症:T值≤-2.5;骨量减少:-2.5microRNA后运用ND-1000 Nanodrop和Agilent 2200 TapeStation程序对样品进行质检,构建文库后进行测序。分别使用log_2Ratio及散点图比较共同表达的microRNA及其表达量的差异,采用edgeR程序来分析各组间microRNA的差异及其显著性,并计算出P值。运用Pearson相关系数r来分析组间的相关性,明确测序结果的可靠程度。进一步筛选出差异倍数较大、表达量较高、既往文献中已证实与骨质疏松症有关的miRNAs标志物。结果:1.A组与C组差异及分析:检测出A组与C组有表达的miRNA共514个,其中有高显著差异的miRNA共316个,有一般显著差异的miRNA共60个。筛选出A组与C组差异倍数较大、表达量较高、既往文献中已证实与骨质疏松症有关的miRNA共37个,其中上调的miRNA共17个,下调的miRNA共20个。2.B组与C组间的差异及分析:检测出B组与C组有表达的miRNA共735个,其中有高显著差异的miRNA共60个,有一般显著差异的miRNA共44个。筛选出B组与C组差异倍数较大、表达量较高、既往文献中已证实与骨量减少及骨质疏松症有关的miRNA共34个,其中上调的miRNA共28个,下调的miRNA共6个。3.A组与B组间的关系:检测出A组与B组共同表达的miRNA为372个,其中均与C组有差异的基因共有39个,表达量较高且有显著性差异的miRNA共5个。结论:1.骨质疏松症患者与正常人群相比,的确存在差异表达的miRNAs。2.检测出的71个高表达量的miRNAs与成骨细胞及破骨细胞有着密不可分的关系,且A组与B组中均与C组有差异的miRNA共有39个,表达量较高且有显著性差异的miRNA共5个。这些miRNAs很可能成为骨质疏松症及骨量减少的潜在分子标志物。但由于样本量偏少,且miRNA本身就存在个体差异,所以还需扩大样本量进行进一步的后期重复验证,验证方法采用荧光定量PCR,以精简及完善骨质疏松症的microRNA表达谱。3.A、B、C三组样本相互之间的表达模式均呈正相关,且均为高相关程度,这说明检测出的microRNAs与骨质疏松症的发生发展有着密切的关系。4.通过对本研究筛选出的血浆外泌体microRNA进行检测,可以及时预测骨质疏松症的发生,进而减少脆性骨折的风险,对骨质疏松症的早期诊断有着重要意义。
  • 【论文】 桑树耐旱关联microRNA及其靶基因鉴定与功能分析

    作者:李瑞雪 关键词:MicroRNA ; 桑树 ; 靶基因 ; 耐旱 ; 功能分析 机构:江苏科技大学 ; 江苏科技大学 年份:2018
    摘要:MicroRNAs(miRNAs)是生物体内一类非编码小RNA分子,长度约为21-24个碱基,主要通过对靶基因mRNA的翻译抑制、降解等负调控的方式在转录后水平精确有效地调控基因的表达。植物miRNA能响应干旱、高盐、低温等非生物胁迫,在植物抗逆过程中发挥重要作用。各种逆境条件会对桑树的生长造成重大影响,研究桑树(Morus alba L.)一些重要的miRNA及其靶基因的功能和它们在胁迫条件下的生理生化、分子适应机制,对提高桑树的抗逆性、保存桑树种质资源和提高桑树产量有重要作用,同时为利用桑树作为生态林树种各方面的作用提供科学支撑。本研究通过高通量深度降解组测序技术系统全面的鉴定了桑树耐旱关联miRNA及其靶基因,通过瞬时转化及VIGS等方法对筛选出的关键miRNA及靶基因的抗旱功能进行了分析,探究了桑树耐旱的分子机制,主要的研究结果如下:一、利用高通量深度降解组测序技术鉴定桑树耐旱关联miRNA及其靶基因通过桑树深度高通量降解组测序,在对照文库(CL)中,分别鉴定出30个保守miRNA家族的409个靶基因和199个新miRNA的990个靶基因,在干旱文库(DL)中,分别鉴定出30个保守miRNA家族的373个靶基因和195个新miRNA的950个靶基因。DL保守miRNA家族中,miR156、miR172和miR396家族靶向最多数量的靶基因,推测这3个保守miRNA家族在桑树响应干旱胁迫中可能起到重要作用。通过分析miRNA-target分子网络图,我们发现在DL特有网络图中,有838个miRNA-mRNA pairs,占DL中总miRNA-mRNA pairs的63.34%。利用荧光定量PCR检测了11个靶基因和12个miRNA在干旱胁迫下的表达模式。通过RLM-5’RACE验证了6个靶基因的剪切位点,证明降解组测序得出的结果是非常准确的。GO注释和KEGG通路分析表明这些靶基因参加广泛的生物过程和各种代谢途径。二、桑树miR166f瞬时转化过表达鉴定其抗旱功能获得了桑树miR166f的前体序列,发现成熟体miR166f在前体的3’臂上,miR166f前体序列最小折叠自由能(MEFs)为-51.70 kcal/mol,具有典型的植物miRNA前体二级结构特征;miR166f 5’端上游除了包含典型的具有转录起始功能的TATA-box和CAAT-box外,还含有多个胁迫响应顺式作用元件和一些激素响应元件;建立了桑树miR166f瞬时转化体系,当转化液浓度OD_(600)为0.7、瞬时转化4 d时,叶片GUS组织化学染色效果最好,同时该处理条件下,叶片中GUS基因和miR166f的表达量与对照叶片中的表达量相比积累最显著,说明适宜浓度的转化液对瞬时转化效率有较大影响和农杆菌介导的瞬时转化有一定的时效性;在桑树中用不同浓度的转化液瞬时转化过表达miR166f后,与对照处理相比,miR166f的2个HD-Zip靶基因和1个JMJD6靶基因的表达水平均出现显著下降;同时叶片相对含水量(RWC)、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和Pro含量含量均出现不同程度的增加,而MDA含量显著降低。结果表明miR166f在桑树的抗逆境胁迫响应中发挥积极作用。三、桑树shabby-related蛋白激酶(MmSK)基因的克隆、表达分析及原核表达克隆获得包括完整ORF的MmSK基因(GenBank No:KY348867),其cDNA序列长为1705 bp,编码411个氨基酸残基,蛋白质分子质量为46.55 Kd,等电点为8.61。保守域结构分析表明,MmSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域,属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族。通过多重序列比对和进化树分析发现,MmSK基因的氨基酸序列与其他比对间的同源性均在89%以上。实时荧光定量PCR分析表明,在桑树不同组织中MmSK基因的相对表达量有较大差异,暗示着MmSK可能参与了植物器官发育的调控,其中,MmSK在韧皮部中表达量最高。桑MmSK基因在高盐、干旱、低温和ABA处理等不同非生物胁迫处理下均上调表达,表明该基因参与了桑树的抗逆过程,为更好地了解MmSK基因在桑树响应逆境胁迫中发挥的作用及分子机制打下了基础。构建了鲁桑MmSK基因的原核表达载体pET-28a(+)-MmSK,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达重组蛋白MmSK。四、桑树VIGS体系的建立及MmSK基因抗旱功能鉴定利用八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因作为报告基因,构建桑树VIGS体系,并利用VIGS技术成功将桑树miR172的靶基因--MmSK基因沉默。MmSK基因沉默后,其在pTRV2-MmSK-VIGS植株的表达量仅为空载pTRV2-00阴性对照组植株的34.02%,差异极显著。在桑树中沉默MmSK基因后,叶片中可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、Pro含量均出现不同程度的降低,而MDA的含量增加显著。在干旱胁迫下,随着干旱胁迫处理时间的延长,叶片中可溶性蛋白含量、Pro含量和MDA含量均逐渐增加,SOD活性和POD活性均呈现先上升后下降的趋势,在第5 d时,达到最大值,与MmSK基因表达量变化趋势一致。表明桑树MmSK基因沉默后,能引起桑树中一些与抗旱相关的酶类活性和代谢物的含量的降低,从而导致其抗旱性能减弱,进一步说明MmSK基因在桑树的干旱胁迫响应中发挥重要作用。本研究通过干旱胁迫桑树降解组高通量测序筛选桑树耐旱关联miRNA和靶基因,分析候选miRNA和靶基因的时空表达特性,通过瞬时转化过表达研究目标miR166f对靶基因表达的调控和对植株抗旱相关生理生化指标的影响;构建了桑树VIGS转化体系,并通过VIGS法鉴定MmSK基因的抗旱功能。研究结果完善了桑树抗旱的分子调控网络,为桑树抗逆机理研究及抗性品种选育提供重要的理论依据和探索途径。
  • 【论文】 脱氧核酶荧光探针用于细胞内microRNA的放大检测

    作者:吴亚楠 关键词:microRNA ; 脱氧核酶 ; 信号放大 ; 检测 ; 细胞 机构:湖南大学 ; 湖南大学 年份:2018
    摘要:microRNA(miRNA)是一类小的单链非编码RNA,可以作为基因表达的关键控制因子,在多种生物过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明,miRNA的异常表达与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。因此,发展高灵敏、高选择性的原位miRNA检测方法具有重要意义。迄今为止,已经开发了多种基于脱氧核酶的探针用于重要金属离子甚至生物分子的检测,因反应条件温和,脱氧核酶探针在细胞内核酸检测方面展示出了广阔的应用前景。本论文基于脱氧核酶发展了两种新型荧光探针用于活细胞内miRNA的放大检测,主要内容如下:(1)构建了一种基于金纳米颗粒的裂开型脱氧核酶用于细胞内miRNA-21的传感。该探针由金纳米颗粒和裂开型脱氧核酶及其底物组成。没有目标物时,裂开型脱氧核酶与其底物通过部分互补形成未激活的脱氧核酶motif,荧光基团被金纳米颗粒和猝灭基团猝灭。探针进入细胞后,miRNA-21会与脱氧核酶结合,在催化中心形成激活的二级结构,激活的脱氧核酶会将底物切断,荧光恢复。与此同时,被释放的目标物会与另一个未激活的脱氧核酶杂交开启下一轮的循环。在这过程中,少量的目标物即可触发并切割多条荧光基团标记的底物链,使其远离金纳米颗粒,荧光增强,实现miRNA-21的高灵敏检测。此外,实验结果表明探针可以快速地进入细胞,并能实现细胞内miRNA-21的成像。(2)发展了一种脱氧核酶级联放大体系用于细胞内miRNA-141的高灵敏检测。该体系由S1、S2、S3组成:S1是含有miRNA-141结合区域和下游引发链的上游发夹封闭型脱氧核酶链,S2是下游发夹封闭型脱氧核酶链,S3是两端分别标记荧光基团和猝灭基团的底物链。无目标物时,S1和S2通过分子内杂交形成发夹结构,使得脱氧核酶的催化活性被抑制,S3的荧光被猝灭基团猝灭。当靶标存在时首先会与上游脱氧核酶杂交,S1随即被激活,在镁离子的辅助下进行自切割,产生的切割片段能激活下游脱氧核酶。与此同时,被释放的miRNA-141会自动与其它的上游脱氧核酶杂交,开启下一轮的循环。被激活的下游脱氧核酶能切割多条底物链,实现信号的放大。实验结果表明,该体系可以极大地增强输出的荧光信号,并能实现活细胞内miRNA-141的成像。
  • 【论文】 基于DNA自组装技术的microRNA传感新方法研究

    作者:李丹丹 关键词:MicroRNAs ; 比色传感 ; DNA自组装 ; DNA纳米镊 ; 化学发光检测 机构:重庆医科大学 ; 重庆医科大学 年份:2016
    摘要:Micro RNAs(mi RNAs)参与细胞生长的一系列重要进程,包括细胞增殖、分化、凋亡及死亡等过程。mi RNAs表达失调将导致细胞的过度生长、增殖及分化,从而导致肿瘤的发生发展,因此,其作为一种潜在的新型核酸类肿瘤标志物和潜在的治疗靶点具有广阔的临床应用前景。现有mi RNA检测方法主要有RT-PCR,微阵列芯片及Northern blot等,虽然这些方法都有一定的优势,但也存在一些不足,如操作繁琐,费时费力、灵敏度低等,这些都会在很大程度上影响其临床实用性。因此,发展简单、实用、快速、灵敏的mi RNAs检测技术对于阐明肿瘤发生发展的机制,寻找新的肿瘤标志物,肿瘤的早期诊断和治疗,探寻新的肿瘤治疗靶点具有重要价值;有助于实现mi RNAs标志物在肿瘤临床诊疗中的应用。本论文整合分子生物学、临床检验诊断学及生物分析化学等学科的最新研究成果,基于功能核酸、DNA自组装和等温扩增技术等,构建两种新颖、简单、快速的mi RNAs传感检测新方法,为肿瘤标志物的早期诊断与治疗提供潜在的检测平台。本研究主要包括以下两个部分:1.核酸信号放大策略用于mi RNA的比色传感整合链替代聚合反应和哑铃状密封探针介导的滚环扩增双重信号放大策略,本研究构建了一个快速、免标记的比色传感器用于mi RNA的高灵敏、高特异性检测。该传感器主要包括4个组成部分,分别是由trigger模板、C-rich DNA修饰的MB,哑铃状滚环模板,剪切酶以及聚合酶。靶mi RNA引发链替代聚合反应,释放滚环模板引物以启动基于toehold的滚环扩增反应,从而扩增出大量富G的DNA(GDNA)序列;GDNA序列与Hemin结合形成DNAzyme催化ABTS2-和H2O2进行比色反应,从而实现对mi RNAs的高灵敏、高特异性检测。该方法检测限低至10 a M,检测线性范围为10 a M~1 n M,能很好的应用于实际样本的检测。本章所构建的mi RNA超灵敏检测方法简单、实用,有望成为肿瘤相关核酸标志物的筛选、临床诊断应用的有力工具。2.新型DNA纳米镊的设计及其多组份miRNA的同时化学发光检测本方法构建了一种基于靶物质诱导纳米结构变化的新型DNA纳米镊,通过结合催化茎环自组装(CHA)和邻位触及形成辣根过氧化物酶模拟酶(DNAzyme),实现了AND逻辑门操作和对多组份mi RNA的同时检测。本研究构建的基于DX(DNA double crossover,DX)模块的DNA纳米镊的包含有信号输入和信号输出结构,两臂中间含弓形结构的DNA双股螺旋作为信号输入的识别域,用于同时特异性甄别两种不同的靶物质;两臂末端的拆分富G序列用于信号输出。利用CHA信号放大策略,少量的靶物质输入可以靶向诱导大量的DNA纳米镊有打开状态转向闭合状态,在Hemin存在时,镊两臂末端的拆分富G序列在邻位触及作用下形成大量DNAzyme,从而产生放大的传感输出信号。两种靶物质通过AND逻辑门诱导调控DNA纳米镊的开关,通过聚丙烯酰胺电泳(PAGE)、表面等离子体共振(SPR)表征了该调控机制,证实新型DNA纳米镊构建成功。构建的生物传感系统在输出的化学发光信号和输入mi RNA之间呈良好的线性关系,检测线达30 f M。该生物传感器可用于复杂的生物样本中mi RNA的检测分析。本方法构建了一个简单,可重复利用的生物传感平台,该传感平台可用于逻辑门的构建以及无酶的高灵敏高特异性的mi RNA检测。
  • 【期刊】 标记探针法用于microRNA的多重可视化检测

    刊名:黑龙江畜牧兽医 作者:孙秀伟 ; 英娜 ; 曲桂娟 ; 万家余 关键词:MICRORNA ; 抓取探针 ; 检测探针 ; 可视化检测 ; 多重检测 ; 显色反应 机构:[1]吉林农业大学动物科学技术学院 ; [1]吉林农业大学动物科学技术学院 ; [2]军事医学科学院军事兽医研究所 年份:2018
    摘要:为了建立研究microRNA快速、灵敏、多重的可视化检测方法,试验采用创新的夹心ELISA方法,以链霉亲和素包被的微孔板为反应平台,根据检测靶标microRNA序列设计标记biotin的抓取探针CP和标记FAM的检测探针DP,抓取探针CP将靶标microRNA固定到微孔板上,优化其最佳孵育时间;标记FAM的检测探针DP与靶标microRNA结合并间接偶联于微孔板上,anti-FAM-HRP与检测探针DP标记的FAM结合,并对其最佳孵育时间进行优化;HRP催化底物TMB,使其发生显色反应,并通过显色反应与酶标仪对靶标microRNA的特异性、灵敏性进行研究。结果表明:CP孵育的最佳时间为2 h;anti-FAM-HRP的最佳孵育时间为2 h;特异性检测时,除靶标外,其他突变序列均显示阴性;灵敏性检测时,检测限为12.75 pmol/L。说明建立的检测方法特异性良好,灵敏度较高,可以同时进行多序列检测,且检测过程可以在6 h之内完成,具有良好的应用性。
  • 【论文】 microRNA在氧醚复合保护脓毒症效应机制中的作用

    作者:邵甜 关键词:microRNA ; 脓毒症 ; 异氟醚 ; 氧气 ; 炎症 机构:第四军医大学 ; 第四军医大学 年份:2016
    摘要:Sepsis(脓毒症)是一种因为感染而导致的一系列病理、生理方面的异常,是导致全世界感染患者致死致残的重要因素,一直是医学界关注的焦点。我们的前期研究证实:(1)0.5MAC异氟醚复合60%氧对脓毒症具有保护效应;(2)通过芯片研究,我们筛选确定了4个脓毒症相关的miRNA:CLP可诱导小鼠外周血白细胞mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p的高表达,给予0.5MAC异氟醚复合60%氧治疗可逆转这4个miRNA的高表达。但这4个miRNA在中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等的表达情况尚不清楚;目前公认的是,巨噬细胞在脓毒症病理生理机制中起关键作用。我们预实验结果表明,LPS刺激可诱导mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在RAW264.7细胞中的表达显著升高。本研究拟探讨mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在氧醚复合治疗脓毒症效应机制中的作用,并探讨这些miRNA成为治疗脓毒症新靶点的可能。材料与方法1.miRNA通过NF-κB信号通路参与氧醚复合保护脓毒症效应(1)细胞实验:将RAW264.7巨噬细胞,随机分为10组:Vehicle组、LPS组、Vehicle+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy组和LPS+LV-/mimic-/antigomo-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy组。用携带LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmu-mi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p质粒的慢病毒感染RAW264.7细胞72 h后,或者转染mi R-133a-3p mimic/antigomo、mi R-141-3p mimic/antigomo、mi R-3074-2-3p mimic/antigomo和mi R-542-3p mimic/antigomo于RAW264.7细胞12 h后,给予细胞100ng/ml LPS刺激至少2小时建立细胞脓毒症模型。氧醚治疗:给予LPS刺激后即刻将细胞置于0.5MAC异氟醚复合60%氧气环境处理2 h。收集细胞培养上清液检测炎症因子TNF-α和IL-1β水平;免疫印迹法检测细胞核蛋白、细胞浆蛋白p65表达情况和全蛋白p-p65、p65表达情况。(2)动物实验:将雄性昆明小鼠随机分为9组:Sham+Air组、CLP+Air组、CLP+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组和CLP+LV-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy组。给小鼠尾静脉注射携带LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmumi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p质粒的慢病毒,48 h后建立CLP脓毒症模型。氧醚治疗:造模后1、6小时分别吸入1小时的氧醚复合气体,对照组在相同时间内吸入空气。记录动物7天存活率。2.抑制miRNA表达对脓毒症的保护效应研究(1)动物实验:将雄性昆明小鼠随机分为8组:Sham组、CLP组、CLP+LV-NC inhibitor/antigomo-NC组、CLP+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomo-mi R-133a-3p组、CLP+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p组、CLP+LV-mi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p组、CLP+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomomi R-542-3p组和CLP+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix组。给小鼠尾静脉注射LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor质粒的慢病毒,48 h后建立CLP脓毒症模型。尾静脉注射miRNA antigomo时间:CLP前48 h或CLP后24 h。记录动物7天存活率。(2)细胞实验:将RAW264.7巨噬细胞,随机分为8组:Vehicle组、LPS组、LPS+LV-NC inhibitor/antigomo-NC组、LPS+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomomi R-133a-3p组、LPS+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p组、LPS+LVmi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p组、LPS+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomo-mi R-542-3p组和LPS+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix组。用携带LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmumi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor质粒的慢病毒感染RAW264.7细胞72 h,或者转染mi R-133a-3p antigomo、mi R-141-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo和mi R-542-3p antigomo于RAW264.7细胞12 h后,给予细胞100 ng/ml LPS刺激2小时建立细胞脓毒症模型。收集细胞培养上清液检测炎症因子TNF-α、IL-1β水平。结果1.本研究中,我们观察到,LPS刺激后,RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-1β显著增多(P<0.05);给予氧醚复合干预可显著抑制LPS刺激所致细胞炎症因子释放的增加(P<0.05)。高表达mi R-133a-3p及mi R-3074-2-3p可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应(P<0.05);高表达mi R-542-3p可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应(P<0.05)。给予mi R-133a-3p mimic、mi R-3074-2-3p mimic及同时给予上述4个miRNA mimic可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应(P<0.05);给予mi R-542-3p mimic及同时给予上述4个miRNA mimic可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应(P<0.05)。给予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著增强氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应(P<0.05);给予mi R-542-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo均可显著增强氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应(P<0.05)。LPS刺激可上调RAW264.7细胞p-p65表达增加,细胞核p65表达增加,细胞浆p65表达减少,提示:LPS刺激后细胞内NF-κB信号通路被激活。给予氧醚复合干预可抑制LPS诱导的NF-κB信号通路激活;预先高表达上述4个miRNA可部分逆转氧醚复合干预对LPS刺激后NF-κB信号通路激活的抑制效应。动物实验:与假手术组相比,CLP组小鼠存活率显著下降(P<0.05),给予氧醚复合可显著提高CLP动物的存活率(P<0.05);高表达mi R-141-3p及同时高表达上述4个miRNA可显著减弱氧醚复合提高CLP小鼠存活率的效应(P<0.05)。2.我们观察到,分别给予mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p inhibitor可提高CLP小鼠的存活率,但没有统计学差异;而同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著提高CLP小鼠的存活率(P<0.05)。此外,造模前同时给予上述4个miRNA antigomo可显著提高CLP小鼠的存活率(P<0.05);造模后分别或同时给予上述4个miRNA antigomo也可提高CLP小鼠的存活率,但没有统计学差异。给予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-3074-2-3p inhibitor及同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液TNF-α水平的增高(P<0.05);给予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-141-3p inhibitor、mi R-542-3p inhibitor和同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液IL-1β水平的增高(P<0.05)。给予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo、mi R-542-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液TNF-α水平的增高(P<0.05);给予mi R-3074-2-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液IL-1β水平的增高(P<0.05)。结论由以上结果可知,(1)miRNA介导的NF-κB炎性通路参与了0.5MAC异氟醚复合60%氧对脓毒症的保护效应;(2)抑制mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p或mi R-542-3p具有抗炎效应,并对CLP所致脓毒症有保护效应,提示这4个miRNA有可能成为治疗脓毒症的新靶点。
  • 【期刊】 房颤心房重构与MicroRNA关系的最新研究进展

    刊名:齐齐哈尔医学院学报 作者:李春生 ; 严中亚 关键词:MicroRNA ; 房颤 ; 心肌纤维化 ; 心房重构 机构:安徽医科大学第二附属医院心脏大血管外科 ; 安徽医科大学第二附属医院心脏大血管外科 年份:2019
    摘要:心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床最常见的心律失常之一,其发病机制尚不完全清楚。心房重构包括电重构、结构重构和自主神经重构,在AF的发生、发展中起着关键作用。近年来研究发现,微小RNA(MicroRNA,miRNA)参与基因转录后水平的调控,与心房重构和AF的发生、发展密切相关。研究发现,miRNA在房颤心房重构中起重要作用,本文就AF心房重构与miRNA关系做一综述。
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