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  • 【论文】 MicroRNA-203通过靶向Lipin1抑制酒精性脂肪肝中肝细胞脂质异常代谢

    作者:程小雨 关键词:酒精性肝病 ; 酒精性脂肪肝 ; MicroRNA-203Lipin1 ; 肝细胞脂质代谢 机构:安徽医科大学 ; 安徽医科大学 年份:2018
    摘要:目的酒精性肝病(Alcohol liver disease,ALD)是一类影响人类健康的全球性肝脏疾病,它包括酒精性肝炎(Alcohol hepatitis,AH),酒精性脂肪肝(Alcohol fatty liver,AFL),酒精性肝纤维化和肝硬化。大量饮酒是导致酒精性肝病的最主要原因。酒精性脂肪肝是酒精性肝病的早期阶段,它伴随着肝细胞大量的脂质积累以及肝细胞的氧化应激。因此有效的逆转酒精性脂肪肝是防止酒精性肝病恶化的重要措施。目前对于酒精性脂肪肝仍缺少有效的治疗药物和方法,阐明酒精性脂肪肝形成的相关分子机制对减少酒精性脂肪肝和酒精性肝病的发生具有重要意义。MicroRNA-203(miR-203)作为肿瘤抑制因子,它能够抑制肝细胞的增殖和迁移进而抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生和发展。本课题组前期通过收集酒精肝病人和正常人血液提取RNA高通量筛查对比发现,miR-203表达在酒精肝病人中降低,但其在酒精性脂肪肝中的作用和机制尚不清楚且亟待研究。Lipin1是Lipin家族的重要一员,它具有Lipin家族共有的调控功能。一方面它能够促进磷脂酸转化为甘油三酯(triglyceride,TG),另一方面又能与过氧化酶激活物增殖受体-α(peroxidase activator proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)形成复合物,调节脂肪酸的氧化。方法本实验重点研究miR-203对酒精性脂肪肝中肝细胞脂质代谢中的作用以及调控Lipin1的相关机制,为酒精性脂肪肝的治疗提供新的靶点。首先建立体内和体外酒精性脂肪肝模型,QPCR检测miR-203的表达变化;确定了miR-203的表达后,体内慢病毒载体过表达miR-203,HE染色和油红染色观察小鼠肝脏的病理变化,Western blot检测脂质代谢指标SREBP-1,PPAR-α,炎症因子IL-6,TNF-α表达水平;同时,体外转染miR-203 mimics过表达miR-203,100mM酒精刺激24h细胞内油红染色观察肝细胞脂质积累情况,检测细胞内甘油三酯和总胆固醇水平,Western blot检测脂质代谢指标SREBP-1,PPAR-α,炎症因子IL-6,TNF-α表达水平;为了进一步探究mi R-203调节脂质代谢的机制,靶基因预测和双荧光素酶报告实验发现miR-203能与Lipin1靶向结合,且能够负调控Lipin1;在体内和体外酒精肝模型中,通过免疫组化以及Western blot检测Lipin1表达水平,进而体外siRNA沉默Lipin1,Western blot检测脂质代谢指标以及脂肪酸合成酶的表达变化;为了探究miR-203对Lipin1亚细胞定位的影响,体外过表达miR-203以后分别提取细胞核蛋白以及细胞质蛋白,Western blot检测Lipin1的表达水平,同时细胞免疫荧光进一步检测miR-203对Lipin1亚细胞定位的影响。结果本实验发现miR-203在酒精性脂肪肝模型中表达降低,并且过表达miR-203后能够抑制酒精性脂肪肝的脂质异常积累以及肝脏的炎症反应;进一步发现miR-203调节肝脏脂质代谢的过程可能与Lipin1有关,沉默Lipin1能够抑制肝脏和肝细胞的脂质异常代谢以及脂肪酸合成酶的表达,而此过程与miR-203调节Lipin1的亚细胞定位有关,过表达miR-203能够促进Lipin1的细胞核转移,且能抑制其细胞质转移。结论miR-203能够抑制酒精性脂肪肝中肝细胞的脂质异常代谢,且此过程与Lipin1的靶向调控有关。