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  • 【期刊】 重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建表达

    刊名:中国组织工程研究 作者:徐华 ; 董耘 ; 杨进 ; 刘少帮 ; 刘少华 ; 陈武 关键词:重组融合蛋白质类 ; 水蛭素类 ; 发酵 ; 组织构建 ; 组织工程 ; 重组葡激酶-水蛭素 ; 融合蛋白 ; 表达 机构:湖北医药学院附属东风总医院麻醉科 ; 湖北医药学院附属东风总医院麻醉科 ; 湖北医药学院附属东风总医院妇产科 ; 湖北医药学院 年份:2015
    摘要:背景:重组融合蛋白是根据凝血酶识别顺序将葡激酶与水蛭素串联而成的蛋白,具有双重功能,分子质量为23 ku,可在工程菌高密度发酵状态下获得高效表达。目的:通过对工程菌进行高密度发酵,构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并探讨其构建可行性及表达价值。方法:对工程菌进行高密度培养,并诱导表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白,对菌体进行离心收取,多次冻融后通过超滤、两部阴离子交换层析方法收集上清液,对重组葡激酶-水蛭素融合蛋白进行分离纯化,观察其纤溶比活性及在菌体中的高效表达价值。结果与结论:发酵培养工程菌,并在第17小时时予以诱导。结果发现,诱导0.5 h时,便能观察到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,且发酵时间越长重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达量相应越大;至发酵20 h时,表达达到顶峰。菌体干质量为32.20 g/L,目的蛋白表达量约为1.48 g/L。经过纯化处理后,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高达98%,纤溶比活性约为2.6×104 IU/mg,回收活性的概率为56%。实验通过构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并分析其表达价值,提示该纯化工艺较为便捷,耗时较短,且能重复使用,可用于大规模生产。
  • 【期刊】 CCL21-CD40L融合蛋白的肿瘤免疫实验研究

    刊名:浙江大学学报(医学版) 作者:宫婷 ; 李鸿立 ; 巴一 关键词:重组融合蛋白质类 ; 趋化因子CCL21 ; CD40配体 ; 基因疗法 ; 结肠肿瘤 ; 疾病模型 ; 动物 机构:天津医科大学总医院肿瘤科 ; 天津医科大学总医院肿瘤科 ; 天津市肿瘤医院消化内科 年份:2013
    摘要:目的:探讨CCL21-exCD40L融合基因的抗肿瘤作用。方法:构建CCL21-exCD40L真核表达载体,Western blot法检测CCL21-exCD40L融合蛋白的表达,Transwell法检测CCL21-exCD40L融合基因趋化活性,体外转染CCL21-exCD40L融合基因,观察其在小鼠结肠癌肿瘤模型中的抗肿瘤作用。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L,Transwell法验证融合蛋白对树突细胞具有较强趋化功能,其每高倍镜视野穿膜细胞数是空载体对照组的14.95倍。将融合基因原位转染肿瘤局部,荷瘤小鼠全部存活,肿瘤体积缩小。结论:CCL21-exCD40L融合基因能通过真核细胞正常表达,CCL21-exCD40L融合蛋白能够趋化树突细胞,在体内发挥抗肿瘤作用。
  • 【期刊】 含人Fc重组凋亡融合蛋白体内外抗肿瘤活性初步研究

    刊名:中国医药生物技术 作者:罗岚 ; 刘洪洪 ; 李祥 ; 范开 关键词:重组融合蛋白质类 ; TNF相关凋亡诱导配体 ; 细胞凋亡 机构:重庆理工大学药学与生物学院 ; 重庆理工大学药学与生物学院 ; 重庆富进生物医药有限公司 年份:2011
    摘要:目的初步研究含人抗体Fc片段的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL-Fc)重组融合蛋白的体内外抗肿瘤活性。方法①体外实验:将人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞、人结肠癌LOVO细胞、人胃癌MKN45细胞、人表皮癌A431细胞、人肝癌HEPG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和小鼠肝癌H22细胞均随机分为TRAIL-Fc重组融合蛋白组、对照组和空白对照组,分别加入浓度为1000、250、62.5、15.6、3.9、0.97ng/ml的TRAIL-Fc重组融合蛋白和TRAIL对照品以及完全培养液,采用MTT法检测TRAIL-Fc重组融合蛋白对7种肿瘤细胞株的体外生长抑制率。②体内实验:腹腔和腋下接种H22细胞建立小鼠肝癌模型,据治疗药物的不同将小鼠随机分为空白对照组、5-Fu组和TRAIL-Fc重组融合蛋白组。测量记录腹腔接种小鼠的腹围和体重以及腋下接种小鼠的肿瘤体积,15d后取外周血处死各组小鼠,计算抑瘤率并检测血清中AST、ALT含量。结果体外实验结果显示,TRAIL-Fc重组融合蛋白对7种肿瘤细胞株的生长均有不同程度的抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖效应;其中对MCF-7细胞的抑制作用最强,其最大生长抑制率为82.5%,其次依次为LOVO(81.9%)、MKN45(52.3%)、H22(51.2%)、Jurkat(50.9%)、HEPG2(35.4%)和A431细胞(20.3%)。与对照品相比,TRAIL-Fc重组融合蛋白对LOVO(IC50为83.5)、MKN45(IC50为243.2)、MCF-7(IC50为84.6)细胞更敏感。体内实验结果显示,空白对照组小鼠腹部明显膨出,后期体重略有下降,肿瘤体积持续显著增加;TRAIL-Fc重组融合蛋白组小鼠腹部轻微膨胀,体重维持较好,肿瘤体积后期略有增加;5-Fu组小鼠腹部无膨胀,体重急剧下降,肿瘤体积明显缩小。TRAIL-Fc重组融合蛋白的抑瘤率为45.79%,AST和ALT检测结果显示其对小鼠肝功能无明显影响。结论 TRAIL-Fc重组融合蛋白具有较强的抑制肿瘤细胞生长的能力,且在体内半衰期明显延长。
  • 【期刊】 Tudor-SN蛋白TSN结构域亚结构片段重组质粒的构建与表达

    刊名:天津医药 作者:钱宝鑫 ; 高星杰 ; 朱梦瑜 ; 杨震霞 ; 宋娟 ; 段中潮 ; 邵洁 ; 杨洁 关键词:重组融合蛋白质类 ; DNA结合蛋白质类 ; 质粒 ; 基因表达 ; 转染 ; 人类Tudor-SN蛋白 机构:天津医科大学免疫教研室 ; 天津医科大学免疫教研室 ; 天津医科大学基础医学研究中心 年份:2011
    摘要:目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。
  • 【期刊】 人Oct4与细胞穿膜肽融合蛋白的表达

    刊名:第二军医大学学报 作者:周承亮 ; 徐凤青 ; 王春红 ; 刘韬 ; 彭新荣 ; 钱其军 关键词:重组融合蛋白质类 ; 八聚体转录因子3 ; 细胞穿膜肽 机构:浙江理工大学生命科学院新元医学与生物技术研究所 ; 浙江理工大学生命科学院新元医学与生物技术研究所 ; 第二军医大学东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室 年份:2010
    摘要:目的通过原核表达获得人Oct4(hOct4)与细胞穿膜肽融合蛋白,优化其表达方法并观察其穿膜效果。方法通过基因工程手段构建了pET原核表达载体,利用BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)蛋白表达菌表达蛋白。Ni亲和纯化方法纯化蛋白,蛋白质印迹分析检测融合蛋白组成。将融合蛋白用罗丹明染色后加入人正常皮肤成纤维细胞株BJ观察其穿膜进入细胞情况。结果构建了pET21a(+)-hOct4-11R-His和pET21a(+)-EGFP-11R-His表达载体,转入大肠杆菌中后诱导获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,经蛋白质印迹分析检测表明融合蛋白正确。经BJ细胞测试,观察到融合蛋白进入细胞中。结论成功获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,且融合蛋白能够高效进入BJ细胞并聚集于细胞核周围。
  • 【期刊】 Fcγ-Derf2载体构建及融合蛋白表达

    刊名:国际检验医学杂志 作者:蔺丽慧 ; 崔玉宝 ; 孔存权 ; 周娟 ; 王娟 ; 彭霞 ; 李莉尬 关键词:重组融合蛋白质类 ; 粉尘螨 ; 基因表达 机构:上海交通大学附属第一人民医院检验科 ; 上海交通大学附属第一人民医院检验科 ; 江苏省盐城市职业技术学校 年份:2010
    摘要:目的构建人IgGFcγ1片段Fcγ与粉尘螨Ⅱ类抗原Derf2嵌合基因真核表达载体pDisplay-Fcγ-Derf2,并转染人HEK293T细胞系瞬时表达,获得Fcγ-Derf2融合蛋白。方法以pMD19-T-Derf2载体为模板,设计引物并加入linker序列,经PCR扩增得到linke-Der f2 DNA片段。经限制性内切酶酶切后,先后将人Fcγ及linker—Derf2基因片段接入pDisplay真核表达载体。用Attractene转染试剂将其转染至HEK293T细胞使之表达融合蛋白。免疫荧光检测转染后72h的HEK293T细胞并裂解细胞进行Western Blot检测。结果pDisplay-Fcγ-Derf2质粒经双酶切鉴定及DNA测序鉴定证实序列完全正确,真核表达载体构建成功。免疫荧光鉴定转染细胞可见明显红色荧光。Western Blot检测证明融合蛋白相对分子质量为40×10^3,与理论预期值相符合,并证明了Fcγ与Derf2双功能特性。结论构建的融合蛋白Fcγ-Der f2符合目的要求。
  • 【期刊】 融合蛋白技术在生物医药领域中的应用

    刊名:国际生物制品学杂志 作者:李征 关键词:重组融合蛋白质类 ; 免疫球蛋白Fc片段 ; 血清白蛋白 机构:成都生物制品研究所生物技术研究室 ; 成都生物制品研究所生物技术研究室 年份:2011
    摘要:在治疗性药物的研发中,效应分子与人免疫球蛋白IgG1 Fc片段或人血清白蛋白形成的融合蛋白疗效不变,但体内半衰期明显延长、药物耐受性增加、副作用减少.在疫苗研发中,抗原分子与毒素分子或Fc形成的融合蛋白是很好的新型疫苗,并能激发细胞免疫.
  • 【期刊】 蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素融合蛋白表达质粒的构建及表达

    刊名:中国生物制品学杂志 作者:高荣凯 ; 王欲晓 ; 张海荣 ; 周丽君 ; 曲佳 关键词:重组融合蛋白质类 ; α-银环蛇毒素 ; SIP技术 机构:海军总医院中心实验科 ; 海军总医院中心实验科 年份:2011
    摘要:目的构建适合选择感染性噬菌体(Selectivelyinfectivephage,SIP)技术筛选的蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素(α-Bungarotox-ins,α-BTXs)融合蛋白表达质粒。方法从银环蛇毒腺中提取总RNA,RT-PCR扩增α-BTXs基因,插入表达载体pTTMIN,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE、Western blot及竞争抑制ELISA法检测融合蛋白的表达。结果获得的α-BTXs基因序列与相关报道完全一致;融合蛋白表达质粒构建正确;融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白的20%,可与抗蛇毒素血清发生特异性反应,且保持了α-BTXs的抗原性。结论成功构建了蛋白Ⅲ-α-BTXs融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白,为利用SIP技术筛选抗α-BTXs人源抗体奠定了基础。
  • 【期刊】 2种Heymann肾炎受体相关蛋白融合蛋白的制备及其意义

    刊名:天津医药 作者:达展云 ; 范亚平 ; 张伟兰 ; 施岚 ; 施辉 ; 陈晓岚 关键词:重组融合蛋白质类 ; 肾小球肾炎 ; 基因表达 ; 遗传载体 机构:南通大学附属医院肾内科 ; 南通大学附属医院肾内科 年份:2009
    摘要:目的:构建Heymann肾炎致病原受体相关蛋白(RAP)全长和羧基端多肽的原核融合表达载体,表达并纯化相应的融合蛋白。方法:通过RT-PCR法获得RAP全长的cDNA,将其与pGEM-T克隆载体连接并转化,对阳性克隆进行测序分析,设计针对RAP全长和羧基端带有EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切位点的特异引物,通过PCR合成RAP全长359个氨基酸和羧基端108个氨基酸的DNA。纯化后与含有GST的pGEX-4T-1载体体外重组连接,亚克隆到感受态细胞BL21中,经IPTG诱导,表达的融合蛋白通过GST-Sepharose 4B亲和层析法纯化,并经SDS-PAGE和Western Blot检测。结果:酶切分析、PCR及DNA序列测定结果表明成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083和pGEX-4T-1-RAP324,含有重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达出RAP全长70ku和羧基端40ku的融合蛋白。Western Blot结果显示分别在分子质量70ku、40ku处出现特异性条带,与理论相符。结论:成功构建了RAP1083、RAP324与pGEX-4T-1融合基因表达载体,融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,为后续研究Heymann肾炎的分子发病机制奠定了基础。
  • 【期刊】 蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素融合蛋白表达质粒的构建及表达

    刊名:《中国生物制品学杂志》 作者:高荣凯 ; 王欲晓 ; 张海荣 ; 周丽君 ; 曲佳 关键词:重组融合蛋白质类 ; α-银环蛇毒素 ; SIP技术 机构:海军总医院中心实验科 ; 海军总医院中心实验科 年份:2011
    摘要:目的构建适合选择感染性噬菌体(Selectivelyinfectivephage,SIP)技术筛选的蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素(α-Bungarotox-ins,α-BTXs)融合蛋白表达质粒。方法从银环蛇毒腺中提取总RNA,RT-PCR扩增α-BTXs基因,插入表达载体pTTMIN,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE、Western blot及竞争抑制ELISA法检测融合蛋白的表达。结果获得的α-BTXs基因序列与相关报道完全一致;融合蛋白表达质粒构建正确;融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白的20%,可与抗蛇毒素血清发生特异性反应,且保持了α-BTXs的抗原性。结论成功构建了蛋白Ⅲ-α-BTXs融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白,为利用SIP技术筛选抗α-BTXs人源抗体奠定了基础。
  • 【期刊】 人sBAFF-DT388融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性研究

    刊名:山东大学学报(医学版) 作者:朱月婷 ; 焦玉莲 ; 崔彬 ; 张捷 ; 游力 ; 赵跃然 关键词:重组融合蛋白质类 ; B淋巴细胞刺激因子 ; 白喉类毒素 ; 大肠杆菌 机构:山东省医学科学院基础医学研究所 ; 山东省医学科学院基础医学研究所 ; 山东大学附属省立医院中心实验室 年份:2011
    摘要:目的制备人B淋巴细胞刺激因子-白喉毒素融合蛋白(hsBAFF-DT388),探讨其靶向B细胞活性。方法根据优化合成的hsBAFF-DT388基因序列设计引物,PCR扩增目的基因并插入克隆载体pMD19-T,采用菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆,重组克隆载体经双酶切后插入表达载体pColdⅡ,并鉴定重组表达载体。重组菌株经ITPG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,经Ni2+-NTA层析柱纯化,检测重组蛋白的生物学活性。结果获得hsBAFF-DT388高效表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。重组蛋白与BAFF受体阳性细胞特异性结合并对人B细胞系Hmy2.CIR具有靶向细胞毒作用。结论成功构建hsBAFF-DT388表达载体,获得具有靶向B细胞活性的重组蛋白,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定基础。
  • 【期刊】 PTD-OD-HA融合蛋白对bcr/abl阳性细胞凋亡的影响

    刊名:肿瘤 作者:黄峥兰 ; 季茂胜 ; 袁颖 ; 黄世峰 ; 刘钉宾 ; 曾建明 ; 温健萍 ; 冯文莉 关键词:重组融合蛋白质类 ; 白血病 ; 髓样 ; 慢性 ; 细胞凋亡 ; 融合蛋白类 ; bcr-abl 机构:重庆医科大学临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室 ; 重庆医科大学临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室 ; 重庆医科大学附属第一医院普外科 ; Canadian ; Blood ; Services 年份:2010
    摘要:目的:研究含有蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)、寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)和HA标签的PTD-OD-HA融合蛋白对几种bcr/abl阳性细胞株细胞凋亡的影响。方法:将前期制备的PTD-OD-HA蛋白作用于几种bcr/abl阳性细胞后,应用FCM法、DNA梯度电泳(DNAladder)和透射电子显微镜检测细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因bax、bcl-2的mRNA和蛋白水平变化。结果:FCM法检测发现,PTD-OD-HA能促进bcr/abl阳性细胞发生凋亡;DNA ladder实验检测发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210和K562细胞DNA电泳有梯状条带;透射电子显微镜观察发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210细胞发生了凋亡;RT-PCR及Western印迹法检测显示,促凋亡基因bax的mRNA及蛋白水平增高,抗凋亡基因bcl-2的mRNA及蛋白水平降低。结论:PTD-OD-HA蛋白可以特异性诱发bcr/abl阳性细胞的凋亡。
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