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  • 【期刊】 小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

    刊名:微生物学免疫学进展 作者:唐媛媛[1,2] ; 朱平[1] ; 邸大琳[1] ; 魏兵[1] ; 鞠吉雨[1] 关键词:小鼠白介素-35 构建 毕赤酵母 分泌表达 机构:潍坊医学院免疫学教研室 ; 潍坊医学院免疫学教研室 ; 潍坊市第二人民医院检验科 年份:2016
    摘要:目的:构建真核酵母表达载体 pPIC9K 与小鼠 IL-35基因的重组质粒 pPIC9K- mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3′端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K- mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以 SDS-PAGE及免疫印迹( Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K- mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。
  • 【期刊】 重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

    刊名:中国酿造 作者:孙玮遥 ; 宋增健 ; 王向东 ; 林剑 关键词:蛋清溶菌酶 ; 毕赤酵母 ; 发酵条件 ; 优化 机构:烟台大学生命科学学院 ; 烟台大学生命科学学院 ; 山东大学医学院 年份:2017
    摘要:该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母(Pichia pastoris) NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律.研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍.
  • 【期刊】 人LOX-1基因毕赤酵母表达载体的构建与表达研究

    刊名:中国当代医药 作者:刘京 ; 于田田 ; 陈玉华 ; 李敬达 ; 陶娅妮 ; 李明英 ; 王晓 ; 陈勇 ; 迟彦 关键词:血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1 ; 真核表达载体构建 ; 毕赤酵母 ; 动脉粥样硬化 机构:大连大学生命科学与技术学院糖脂代谢重点实验室 ; 大连大学生命科学与技术学院糖脂代谢重点实验室 年份:2016
    摘要:目的 构建血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)真核表达载体,筛选高表达菌株,为体外获得有活性重组蛋白奠定基础.方法 以实验室保存的含有人源LOX-1基因的质粒为模板PCR扩增LOX-1基因,经过TA克隆后亚克隆至酵母表达载体pPICZαA,将获得的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33,利用原位双膜法快速检测阳性高表达菌株,最后经过甲醇诱导,采用Western blot检测LOX-1的表达.结果 成功构建LOX-1真核表达载体,双膜法筛选到高表达菌株;Western blot结果显示,LOX-1在上清中得到表达.结论 LOX-1基因在毕赤酵母细胞上清中得到表达,为体外获得活性重组蛋白和研究其致动脉粥样硬化功能奠定基础.
  • 【期刊】 毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展

    刊名:福建畜牧兽医 作者:杨婕 关键词:毕赤酵母 ; O-糖基化 ; N-糖基化 ; 糖基人源化 机构:福建师范大学生命科学学院 ; 福建师范大学生命科学学院 年份:2014
    摘要:毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主,不仅具有原核生物表达系统的优点,如培养成本低、遗传操作简单、表达效率高等,还可以对表达的外源蛋白进行翻译后修饰加工,如蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化等,因而有其独特的优势。在分泌蛋白修饰中,糖基化是一种重要修饰方式,影响蛋白的结构与功能。本文就毕赤酵母表达的分泌蛋白进行糖基化修饰及糖基人源化改造研究进展进行综述。
  • 【期刊】 不同信号肽对毕赤酵母表达漆酶的影响

    刊名:微生物学报 作者:石艺平 ; 周雪 ; 胡美荣 ; 林剑辉 ; 陶勇 ; 黄建忠 关键词:毕赤酵母 ; 信号肽 ; 漆酶 机构:福建师范大学生命科学学院 ; 福建师范大学生命科学学院 ; 山东大学威海分校 ; 中国科学院微生物研究所 年份:2014
    摘要:【目的】从毕赤酵母X-33的内源分泌蛋白中寻找高分泌能力的信号肽,以提高漆酶POXA1c的表达水平。【方法】通过二维电泳的数据分析,以及毕赤酵母的基因组测序结果筛选出7种毕赤酵母中高分泌水平的蛋白,利用其引导漆酶的分泌,通过测定漆酶的活力,来确定信号肽的分泌能力。【结果】七种信号肽都能引导漆酶的分泌,其中PHO5和FLO10信号肽,其引导下漆酶POXA1c的活力分别是自身信号肽引导下的2.5倍和2倍。组合信号肽FLO10-αpro和PHO5-αpro引导下漆酶的活力分别为自身信号肽引导下的3倍和3.5倍,分别比在α-MF引导下提高了20%和40%。【结论】毕赤酵母内源分泌蛋白的信号肽可以有效的引导外源蛋白的分泌,漆酶POXA1c在PHO5-αpro信号肽引导下,通过高密度发酵培养后,其漆酶活力达到57.98 U/m L。
  • 【期刊】 利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

    刊名:生物工程学报 作者:潘阳 ; 吴丹 ; 吴敬 关键词:毕赤酵母 ; 游离型载体 ; 木聚糖酶 ; GAP启动子 ; 蛋白质表达 机构:江南大学食品科学与技术国家重点实验室 ; 江南大学食品科学与技术国家重点实验室 ; 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室 年份:2018
    摘要:巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖︰甘油=1︰2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。
  • 【期刊】 人TLR2胞外区基因酵母表达载体的构建及表达研究

    刊名:现代检验医学杂志 作者:孙守勋 ; 刘静 ; 解立威 ; 柏雪婷 ; 单娜 ; 孟冬娅 关键词:人Toll样受体2 ; 基因表达 ; 酵母双杂交 机构:中一东北国际医院临床检验中心 ; 中一东北国际医院临床检验中心 ; 沈阳军区总医院检验科 年份:2018
    摘要:目的在真核生物酵母细胞中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因。方法以重组质粒pAdTrack-TLR2为模板,应用PCR方法扩增TLR2胞外区基因,克隆到pMD18-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母菌Y187,测定其在Y187中的自激活现象及毒性,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果成功扩增出TLR2胞外区基因,测序结果与GenBank中序列一致。酶切回收的目的基因成功克隆入酵母表达载体pGBKT7中并转化酵母菌Y187后证实无重组质粒的自激活作用,Western blot分析显示该基因在酵母细胞中表达。结论成功构建了TLR2胞外区基因的酵母表达载体,并在酵母细胞Y187中正确表达,为后续研究奠定了基础。
  • 【期刊】 鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白的毕赤酵母表达研究

    刊名:中国地方病防治杂志 作者:王照 ; 关心 ; 丛显斌 ; 吴丹 ; 刘冬冬 关键词:鼠疫菌 ; 抗原蛋白 ; 耶尔森菌 ; Pla ; 毕赤酵母表达 ; 分泌表达 ; 入侵过程 ; 酵母基因组 ; 重组蛋白 ; 密码子 机构:吉林省地方病第一防治研究所 ; 吉林省地方病第一防治研究所 ; 吉林省动物疫病预防控制中心 年份:2016
    摘要:鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌,它所分泌表达的Pla纤维蛋白溶解酶原激活因子抗原蛋白在鼠疫菌对宿主的机体入侵过程中发挥重要作用,敲除Pla表达基因的鼠疫菌不能通过皮下直接入侵宿主,而要通过静脉或腹腔直接感染才能成功入侵致病,说明Pla抗原蛋白主要对机体的皮下保护组织产生作用。
  • 【期刊】 耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

    刊名:食品与生物技术学报 作者:刘强 ; 田亚平 关键词:铜绿假单胞杆菌 ; 耐热氨肽酶 ; 基因克隆 ; 培养条件优化 机构:江南大学工业生物技术教育部重点实验室 ; 江南大学工业生物技术教育部重点实验室 年份:2018
    摘要:为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体pPIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达 对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co2+浓度50 μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L.在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg.实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达.
  • 【期刊】 毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性分析

    刊名:中国生物制品学杂志 作者:张培彪 ; 张苏 ; 孙颖 ; 刘忠 关键词:毕赤酵母 ; 胰岛素前体 ; 不均一性 机构:鲁南制药集团股份有限公司 ; 鲁南制药集团股份有限公司 年份:2017
    摘要:目的 对毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性进行分析.方法 应用疏水层析和C18反相制备,对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、质谱相对分子质量分析,并进行C-末端和N-末端测序.结果 SDS-PAGE测定为单一条带,SEC-HPLC测定为单一峰,但RP-HPLC检测结果出现2个峰;峰2相对分子质量为5 959,是正常的胰岛素前体,峰1为两种混合物,相对分子质量分别为5 716和5 816,可能是缺少了1~2个氨基酸产物;N-末端分别缺少了1个氨基酸(Phe)和2个氨基酸(Phe-Val),C-末端未发生降解.结论 利用毕赤酵母得到的人胰岛素前体存在不均一现象,为胰岛素制备提供了新思路.
  • 【期刊】 多拷贝毕赤酵母表达猪胰岛素前体的动力学模型

    刊名:化工学报 作者:陈丽 ; 王玥 ; 郭美锦 ; 储炬 ; 庄英萍 关键词:重组毕赤酵母 ; 猪胰岛素前体表达 ; 拷贝数 ; 动力学模型 机构:江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心 ; 江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心 ; 华东理工大学上海生物制造技术协同创新中心 年份:2016
    摘要:以携带多拷贝猪胰岛素前体(PIP)基因的毕赤酵母(Pichia pastoris)为供试菌株,对分批补料发酵PIP合成动力学模型进行研究。建立了不同拷贝数毕赤酵母发酵合成PIP的菌体生长、产物合成和底物消耗的动力学模型,并通过Origin8.0软件对模型参数进行了非线性拟合。根据动力学模型结果发现,随着拷贝数的增加与菌体生长相关的产物系数α和细胞生长代谢系数k1绝对值不断增加,12拷贝时PIP表达量达到最高,说明只有进一步促进高拷贝菌株细胞生长并减少其代谢负担才能更有效地提高产物的生成速率。同时表明:预测值与实验值有良好的拟合性,所建模型能较好地反映分批补料发酵过程PIP的合成。
  • 【期刊】 荒漠甲虫小胸鳖甲抗冻蛋白的酵母表达及应用

    刊名:生物工程学报 作者:孟闪闪 ; 蔡文萍 ; 马纪 关键词:抗冻蛋白 ; 低温保存 ; 应用 ; 巴斯德毕赤酵母 ; 血细胞 机构:新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室 ; 新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室 年份:2015
    摘要:昆虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)的抗冻活性很高,可应用于生物组织和细胞的低温保存。为了在酵母表达荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis抗冻蛋白Mp AFP698,并确定其在低温下的保护作用,本文通过构建真核表达载体p PIC9K-Mpafp698,转化巴斯德毕赤酵母GS115,诱导表达小胸鳖甲抗冻蛋白Mp AFP698。利用免疫印迹(Western blotting)分析Mp AFP698蛋白的特异性表达,结果显示Mpafp698基因可整合到酵母基因组中并分泌表达,且酵母自身蛋白很少分泌表达。检测抗冻蛋白的低温保护作用,结果发现,小胸鳖甲抗冻蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等器官的细胞形态,降低血细胞在4℃的溶血率,提高SF9细胞冻融后的存活率。本研究表明,小胸鳖甲AFP可以在毕赤酵母中分泌表达,便于纯化,有良好的低温保护效果。
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