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  • 【专利】 一种基于cHS4元件的哺乳动物细胞附着体表达载体、表达系统、制备方法和应用

    作者:赵春澎 ; 王天云 ; 王小引 ; 张玺 ; 徐光华 ; 付笑笑 ; 高向征 ; 白可可 年份:2016
    摘要:本发明公开了一种基于cHS4元件的哺乳动物细胞附着体表达载体、表达系统、制备方法和应用,属于基因工程与基因治疗技术领域。鸡超敏感位点4(cHS4)是一种经典绝缘子元件,具有増强子阻断与异染色质屏障的功能,能将转基因沉默的主要原因‑位置效应降到最低,还能降低外源启动子及增强子造成邻近基因异常表达的概率。本发明将cHS4序列引入载体的多克隆位点即eGFP下游处,一方面能克服转基因沉默,另一方面还能介导外源基因在无选择压力的情况下在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达,且安全性较好。
  • 【期刊】 MAR提高重组CHO细胞中转基因表达的分子特性分析

    刊名:中国生物化学与分子生物学报 作者:赵春澎 ; 孙秋丽 ; 张俊河 ; 王小引 ; 王天云 关键词:核基质结合区 ; CHO细胞 ; 渐次克隆 ; 转基因表达 机构:新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 ; 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 年份:2016
    摘要:分析核基质结合区(matrix attachment region,MAR)调控转基因表达的分子序列特征,鉴定能有效提高CHO细胞转基因表达的MAR特征性元件。将人β-珠蛋白MAR片段从5'到3'端分为6个分段(1~540,421~1 020,901~1 500,1 381~1 980,1 861~2 460,2 341~2 999位置),分别采用PCR进行克隆,经测序证实正确后,分别连接到含有氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)报告基因的表达载体SV40启动子及上游,构建β-珠蛋白MAR渐次片段介导的表达载体,转染CHO细胞,G418筛选出稳定表达细胞株,ELISA分析CAT报告基因的表达水平,生物信息学分析MAR序列特征。结果表明,β-珠蛋白MAR全长能显著提高转基因的表达,6个渐次片段相比较,421~1 020位的第2个分段和901~1 500位的第3个分段提高转基因表达作用显著。生物信息学分析结果显示,MAR-like motif有助于转基因表达提高。
  • 【期刊】 富含GC的DNA片段对中国仓鼠卵巢细胞中转基因表达的影响及其位置效应

    刊名:新乡医学院学报 作者:赵春澎 ; 陈思佳 ; 张俊河 ; 王小引 ; 王天云 关键词:富含GC的DNA片段 ; 转基因 ; 位置效应 机构:新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 ; 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 年份:2017
    摘要:目的 分析富含GC的DNA片段对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中转基因表达水平的影响及其位置效应.方法 人工合成富含GC的DNA片段,将其克隆到表达载体的表达盒的5"、3"端及两端,构建在载体不同位置插入富含GC DNA片段的3个新表达载体(pIRES-G1、pIRES-G2和pIRES-G3),分别转染CHO细胞并用荧光显微镜进行观察;对照载体为pIRES-EGFP.采用G418筛选稳定细胞株,流式细胞术分析增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测其转基因拷贝数.结果 成功构建了在载体不同位置含有GC DNA片段的3个载体,瞬时及稳定转染结果显示,在载体表达盒两端及3"端插入富含GC DNA片段能够明显提高EGFP在CHO细胞中的表达水平.与对照载体比较,稳定表达情况下载体表达盒两端及3"端插入富含GC DNA能分别提高转基因表达水平约1.39、1.32倍,而在5"端插入富含GC DNA片断对于提高基因表达水平作用尚不明显.表达盒两端及3"端插入富含GC DNA片段的转基因拷贝数比对照载体提高了约1.32、1.24倍.结论 富含GC的DNA片段在CHO细胞提高转基因表达与其在载体上的位置有关,在载体表达盒两端或3"端插入一段富含GC的DNA片段可以提高转基因表达水平.
  • 【专利】 一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用

    摘要:本发明公开了一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用,属于基因工程与基因治疗技术领域。本发明以pEGFP?C1为出发载体构建含核基质结合区特征性序列(如SEQ ID NO:1所示)的附着体表达载体,并以EF?1α启动子(如SEQ ID NO:2所示)替换pEGFP?C1载体上原CMV启动子,得到的pEME载体能高效、持续、稳定表达外源目的基因。
  • 【期刊】 重组CHO细胞中不同启动子对含MAR表达载体转基因表达的影响

    刊名:重庆医学 作者:赵春澎 ; 李琴 ; 王小引 ; 孙秋丽 ; 王天云 关键词:MAR ; 启动子 ; 转基因表达 ; CHO细胞 机构:新乡医学院分析测试实验室 ; 新乡医学院分析测试实验室 ; 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 年份:2017
    摘要:目的分析在重组CHO细胞中不同启动子对含核基质结合区(MAR)表达载体转基因表达的影响。方法 PCR扩增CMV启动子及β-珠蛋白MAR,构建含β-珠蛋白MAR表达载体pCAT1,随后将CMV启动子替代pCAT1上SV40启动子构建CMV启动子驱动的表达载体pCAT2。pCAT1、pCAT2不含MAR的对照载体同时转染CHO细胞,G418筛选稳定转化的细胞株,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的表达水平。结果含MAR表达载体转染的细胞CAT酶表达量比不含MAR的pCATG和pCAT3载体转染的细胞高,分别提高2.14倍和1.25倍(P<0.05);而由SV40启动子驱动含MAR表达载体pCAT1转染的细胞CAT酶表达水平明显比由CMV启动子驱动的pCAT2载体高3.26倍(P<0.05)。结论在稳定重组CHO细胞中MAR能够提高转基因的表达水平,SV40启动子与MAR组合其启动效率优于CMV启动子与MAR组合。
  • 【期刊】 分层教学在医学生物化学与分子生物学实验教学中的应用

    刊名:科教导刊(中旬刊) 作者:赵春澎 ; 李翠萍 ; 张伟 关键词:医学生物化学 ; 分子生物学 ; 实验教学 ; 分层教学 ; 教学改革 机构:新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 ; 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 年份:2015
    摘要:医学生物化学与分子生物学实验是联系医学理论知识与实践应用的重要学科,对培养学生的动手能力、科研素质、创新能力等有重要的启示作用。但传统医学生物化学与分子生物学实验教学存在理论知识更新迅速,实验内容陈旧落后;学生被动参与实验课程,机械重复课本操作等局限性,不利于医学学生参与实践和发展创新能力。针对这些弊端,本文根据各学生对生物化学与分子生物学知识的掌握程度、能力水平及个人发展方向等教育资源的差异,提出"分层教学"的概念,将实验课分为基础实验、综合实验、设计性实验,并分析了"分层教学"对生物化学与分子生物学实验教学改革的重要作用。
  • 【期刊】 漆斑菌Myrotheciumsp.IMER1液体和固体发酵产胆红素氧化酶分析

    刊名:《科技与创新》 作者:赵春澎 ; 刘友勋 ; 闫明阳 ; 黄娟 关键词:胆红素氧化酶 ; 漆斑菌 ; 液体发酵 ; 固体发酵 机构:新乡医学院基础医学院 ; 新乡医学院基础医学院 ; 华中科技大学生命科学与技术学院 年份:2015
    摘要:为了提高漆斑菌Myrothecium sp.IMER1的胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOX)产量,分析了其液体和固体发酵产酶的特性。首先分析了该菌株液体和固体发酵产 BOX 的时间变化曲线,对其所产的胞外酶进行了活性电泳,进一步分析了其液体产酶的模型和宏观动力学内容。结果表明,菌株IMER1在液体发酵中第5天的产BOX酶量最大,其固体发酵产酶量最大时间也是在第5天,但是,其固体发酵能持续高产BOX。从BOX的底物活性显色中可知,在固体和液体发酵的粗酶液中都能检测到BOX,并且没有同工酶出现;而BOX生物合成模式为中期合成型,通过数据计算和模拟得出了产酶动力学方程。
  • 【期刊】 漆斑菌Myrothecium sp.IMER1液体和固体发酵产胆红素氧化酶分析

    刊名:科技与创新 作者:赵春澎 ; 刘友勋 ; 闫明阳 ; 黄娟 关键词:胆红素氧化酶 ; 漆斑菌 ; 液体发酵 ; 固体发酵 机构:新乡医学院基础医学院 ; 新乡医学院基础医学院 ; 华中科技大学生命科学与技术学院 年份:2015
    摘要:为了提高漆斑菌Myrothecium sp.IMER1的胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOX)产量,分析了其液体和固体发酵产酶的特性。首先分析了该菌株液体和固体发酵产BOX的时间变化曲线,对其所产的胞外酶进行了活性电泳,进一步分析了其液体产酶的模型和宏观动力学内容。结果表明,菌株IMER1在液体发酵中第5天的产BOX酶量最大,其固体发酵产酶量最大时间也是在第5天,但是,其固体发酵能持续高产BOX。从BOX的底物活性显色中可知,在固体和液体发酵的粗酶液中都能检测到BOX,并且没有同工酶出现;而BOX生物合成模式为中期合成型,通过数据计算和模拟得出了产酶动力学方程。
  • 【期刊】 响应面法对漆斑菌液体发酵产胆红素氧化酶条件的优化

    刊名:湖北农业科学 作者:赵春澎 ; 刘友勋 ; 闫明阳 ; 黄娟 关键词:胆红素氧化酶 ; 漆斑菌(Myrothecium sp.IMER1) ; Plackett-Burman设计 ; 响应面法 机构:新乡医学院基础医学院 ; 新乡医学院基础医学院 ; 华中科技大学生命科学与技术学院 年份:2015
    摘要:对漆斑菌(Myrothecium sp.IMER1)菌株液体发酵产胆红素氧化酶的条件进行了优化。采用单因素试验筛选出最适碳源为葡萄糖,氮源为硝酸铵,p H为7,温度为28℃和最有效促进产酶的金属离子为Cu2+。在此基础上,利用Plackett-Burman设计对影响产酶因素的效应进行评价,筛选出具有显著影响的3个因素葡萄糖、p H和温度。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得出p H、温度和葡萄糖分别为5.7、28℃、8 g/L时,优化后液体发酵液中胆红素氧化酶活力提高到0.627 U/m L,比未优化前的酶活力0.214 U/m L提高了近2倍,结果表明单因素与响应面结合法可优化菌株IMER1液体发酵产胆红素氧化酶的条件。
  • 【期刊】 活性电泳切胶法分离白腐菌(Trametes sp.B1)2种漆酶同工酶及其性质研究

    刊名:江苏农业科学 作者:赵春澎 ; 刘友勋 ; 黄娟 ; 闫明阳 ; 张文博 ; 张煜 关键词:白腐菌 ; 漆酶同工酶 ; 纯化 ; 活性电泳 ; 酶学性质 机构:新乡医学院基础医学院 ; 新乡医学院基础医学院 年份:2015
    摘要:对白腐菌(Trametes sp.)菌株B1的固体发酵粗酶液进行活性电泳后发现含有5种漆酶同工酶。硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和Sephadex G100柱层析的收集液中包含有2种带电荷和分子量接近的漆酶同工酶,进一步利用活性电泳切胶法纯化出这2种同工酶,用SDS-PAGE证明为单一漆酶,它们的分子量分别为64 ku(Lac1)和62 ku(Lac2),并对其理化性质进行了研究。Lac1漆酶反应的最适p H值为2.2,最适温度为50℃,氧化ABTS的Km值为1.952 mmol/L;Lac2漆酶反应的最适p H值为2.2,最适温度为40℃,氧化ABTS的Km值为0.255 mmol/L。
  • 【期刊】 亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与精神分裂症关系的Meta分析

    刊名:重庆医学 作者:赵春澎 ; 谭利娜 ; 张永红 ; 王敏 ; 卢爱莲 ; 李强 关键词:亚甲基四氢叶酸还原酶 ; 精神分裂症 ; 多态性 ; 单核苷酸 ; meta分析 机构:郑州市儿童医院 ; 郑州市儿童医院 ; 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 ; 新乡医学院第二附属医院心身二科 年份:2012
    摘要:目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点多态性与精神分裂症易感性的关系。方法检索精神分裂症组和对照组MTHFR基因C677T位点多态性的优势比(OR)值或相对危险度(RR)值为效应指标的相关文献,对符合入选标准的文献,应用RevMan 5.0软件对各研究结果进行异质性检验和效应值合并,并进行敏感性分析和偏倚评估。结果纳入MTHFR基因C677T位点多态性文献11篇,共计病例5 719例,其中,精神分裂症组2 630例,对照组3 089例,各研究异质性检验(P<0.05),采用随机效应模型,第677位点CT、TT、CT+TT基因型的合并OR值(95%CI)分别为1.20(0.99~1.46)、1.58(1.09~2.29)、1.28(1.03~1.59),Z值分别为1.86、2.44、2.27,P值分别为0.06、0.01、0.02。除CT基因型的敏感性分析不稳定外,其他两型稳定。3种基因型的漏斗图形均对称。结论 MTHFR基因677TT、CT+TT基因型为精神分裂症发生的危险因素。
  • 【期刊】 小鼠感染伯氏疟原虫后TLR2、9、11及其下游因子表达量的变化

    刊名:中国病原生物学杂志 作者:赵春澎 ; 孙斐 ; 许兵红 关键词:Toll样受体 ; RT-PCR ; 疟原虫 ; 伯氏 ; 小鼠 机构:新乡医学院寄生虫学教研室 ; 新乡医学院寄生虫学教研室 ; 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室 年份:2012
    摘要:目的了解小鼠感染伯氏疟原虫后Toll样受体(TLRs)的免疫作用。方法用伯氏疟原虫感染小鼠,采用RT-PCR、ELISA等方法测定TLRs的mRNA和下游炎症因子血清水平。结果小鼠感染伯氏疟原虫后TLR2、9、11的mRNA分别升高3、3.5和6倍;在感染后96h,IL-6、TNF-α及IL-12均达到峰值,分别为10 023U/ml、485pg/ml和186pg/ml;IL-18持续升高,在144h为4 225pg/ml。结论小鼠感染伯氏疟原虫后TLRs mRNA表达上调,并增强下游炎症因子的表达。