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  • 【期刊】 树突状细胞电穿孔法转染条件的优化

    刊名:生物技术世界 作者:鲁世绒 关键词:电穿孔 ; 树突状细胞 机构:广西医科大学 ; 广西医科大学 年份:2016
    摘要:目的将带有EGFP的质粒电转入树突状细胞,探讨不同电转条件对树突状细胞的电转率和存活率影响。方法分离人外周血单核细胞加入刺激因子将其诱导为成熟DC,设置不同电转参数将质粒转入树突状细胞,荧光显微镜检测转染效率及细胞存活率。结果电转48小时后,镜下观察在电转条件为300V,20ms时,细胞存活率及表达率最高,结论选择适当的电转参数及细胞浓度,可明显提高转染效率同时降低细胞死亡率。
  • 【期刊】 大肠埃希菌TG1电穿孔法转化条件优化研究

    刊名:生物技术进展 作者:蒋华波 ; 夏梓元 ; 张琼阁 ; 王超群 ; 郑骄阳 ; 陆斌 关键词:大肠埃希菌TG1 ; 电穿孔转化 ; 转化效率 机构:第二军医大学药学院 ; 第二军医大学药学院 ; 生化药学教研室 ; 上海市长征医院内分泌科 年份:2017
    摘要:为了确立稳定的高效率电转化方案,提高构建文库的库容,分别对细菌培养温度、生长状态、电场强度、感受态细胞浓度和体积、外源基因的质量、甘油/甘露醇缓冲液体积等条件进行优化,分析了各因素对转化效率的影响.结果显示:细菌培养温度为16℃,细菌生长的OD600值为0.5,密度梯度离心洗涤法,感受态细胞浓度高于1×1011/mL,并设定电场强度14.25 kV/cm时进行电穿孔,转化效率最高,可达到9× 109 CFU/μg DNA.研究获得的电转化优化条件为高库容文库的构建提供了一个重要的途径.
  • 【期刊】 电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

    刊名:第二军医大学学报 作者:张放 ; 周载鑫 ; 张丹丹 ; 房贺 ; 刘善荣 关键词:电穿孔 ; 成纤维细胞 ; 细胞存活 ; 转染效率 ; 脉冲 机构:第二军医大学长海医院实验诊断科 ; 第二军医大学长海医院实验诊断科 ; 解放军东部战区73901部队 ; 第二军医大学长海医院实验诊断科 ; 第二军医大学长海医院临床实验中心 ; 第二军医大学长海医院烧伤科 年份:2017
    摘要:目的 通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件.方法 通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞.利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24 h后的转染效率.结果 在低电压模式下,脉冲电压320 V、质粒浓度为20 μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)%,细胞存活率为(74.30±3.01)%.结论 优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础.
  • 【期刊】 电穿孔法介导siRNA高效转染小鼠原代软骨细胞

    刊名:医学研究杂志 作者:刘安军 ; 麻献华 ; 杨瑞 ; 高琳 ; 陈李斌佶 ; 章卫平 ; 谢志芳 关键词:原代软骨细胞 ; RNA干扰 ; siRNA ; 电穿孔 机构:中国人民解放军第二军医大学基础部 ; 中国人民解放军第二军医大学基础部 ; 上海中国人民解放军第二军医大学基础部 年份:2015
    摘要:目的建立小鼠原代软骨细胞高效电转si RNA的方法。方法常规分离得到的小鼠原代软骨细胞继续用链丝菌蛋白酶消化3h,然后应用高效电转缓冲液和优化的电转参数转染p CMV-EGFP表达质粒或si RNA,用台盼蓝检测细胞存活率;转染后48h分析转染效率和si RNA靶分子的m RNA和蛋白表达水平。结果电穿孔后原代软骨细胞的存活率>80%,质粒的转染效率达到37.3%±5.2%;si RNA靶分子的m RNA和蛋白表达水平分别下调了75%和66%。结论成功建立了通过电穿孔介导si RNA转染小鼠原代软骨细胞的方法,达到了很好的基因沉默效果且保持了较高的细胞存活率。
  • 【期刊】 脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较

    刊名:重庆医学 作者:张禾璇 ; 单可人 ; 何燕 ; 张婷 ; 王婵娟 ; 官志忠 关键词:电穿孔 ; 脂质体转染 ; HepG2细胞 ; SGC7901/ADM细胞 ; pcDNA3.1-EGFP 机构:贵州省妇幼保健院优生遗传科 ; 贵州省妇幼保健院优生遗传科 ; 贵州省医学分子生物学重点实验室 年份:2014
    摘要:目的对比脂质体与电穿孔法对HepG2、SGC7901/ADM两种细胞的转染效率。方法以HepG2、SGC7901/ADM细胞为研究对象,采用脂质体法和电穿孔法分别转染pcDNA3.1-EGFP质粒,流式细胞仪计算细胞存活率,借助绿色荧光标志蛋白eGFP测算转染效率。结果利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为(20.8±2.1)%,而电穿孔法转染效率增高至(49.6±2.5)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901/ADM细胞所获得的阳性转染率为(25.4±1.3)%,而电穿孔法转染效率增高至(52.6±2.1)%,二者比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论使用电穿孔法能明显提高大片段载体的转染效率。
  • 【期刊】 探讨电穿孔法介导转染32DP210细胞的参数

    刊名:中国卫生检验杂志 作者:吕远栋 ; 王雅珍 ; 徐伟红 ; 陶萍华 ; 林兵 关键词:32DP210细胞 ; 电穿孔 机构:浙江省老年医学重点实验室 ; 浙江省老年医学重点实验室 ; 浙江省老年病研究所 年份:2012
    摘要:目的:采用电穿孔法将质粒pGenesil-1(简称pG)转染32DP210细胞,从中寻找最佳的参数。方法:分别采用LipofectamineTM2000、transfast、脂质体DMRIC-E和电穿孔法,将能表达G418抗性蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pG转染32DP210细胞;荧光显微镜下观察GFP表达并测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果:本实验室电穿孔法介导的32DP210细胞转染其最佳电转条件为电压270 V,电容950μF,DNA剂量14μg。48 h后电穿孔法的转染效率达50.81%,其它三种方法转染效率都小于3%。结论:用电穿孔法将质粒pG转染32DP210细胞是最佳的转染方法。
  • 【期刊】 电穿孔法介导转染老年人成纤维细胞参数的优化

    刊名:中国卫生检验杂志 作者:王雅珍 ; 杨舟鑫 ; 徐伟红 ; 吕远栋 ; 毛根祥 关键词:老年人 ; 成纤维细胞 ; 电穿孔 机构:浙江医院浙江省老年医学重点实验室浙江省老年医学研究所 ; 浙江医院浙江省老年医学重点实验室浙江省老年医学研究所 年份:2015
    摘要:目的探究采用电穿孔法将质粒pGenesil-1(简称p G)转染老年人成纤维细胞,从中寻找最佳的参数。方法采用电穿孔法将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒p G转染老年人成纤维细胞。荧光显微镜下观察EGFP表达并测定转染效率、细胞存活率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果本实验室电穿孔法介导的老年人成纤维细胞转染的最佳电转条件:电压:240 V;电容:750μF;DNA剂量:8μg。48 h后电穿孔法的转染率接近30%。结论用电穿孔法将质粒pG稳定转染老年人成纤维细胞耗时短,有利于在体外对老年人成纤维细胞进行后续实验。
  • 【期刊】 电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化

    刊名:江苏农业科学 作者:张庆晓 ; 王慧利 ; 孟春花 ; 王锋 ; 曹少先 关键词: ; 胎儿成纤维细胞 ; 电穿孔 ; 转染 ; 效率 ; 增强型绿色荧光蛋白 机构:南京农业大学动物科技学院 ; 南京农业大学动物科技学院 年份:2012
    摘要:以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响。结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著。不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率。质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8%。
  • 【期刊】 电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的最佳条件

    刊名:中国组织工程研究 作者:王泽 ; 李春花 ; 张宁坤 ; 高连如 ; 陈宇 关键词:脐带 ; 间质干细胞 ; 转染 ; 组织工程 ; 电穿孔 ; 电转染 ; 华通胶间充质干细胞 ; 华通胶 ; 低氧培养 ; 干细胞 ; 国家自然科学基金 机构:安徽医科大学海军临床学院 ; 安徽医科大学海军临床学院 ; 解放军海军总医院心血管内科 年份:2018
    摘要:背景:脐带华通胶间充质干细胞是目前较为原始的干细胞,为当前干细胞的研究热点之一,是基因治疗的理想载体。然而,目前尚未有对脐带华通胶间充质干细胞电转染条件的研究,因此探索脐带华通胶间充质干细胞的电转染最佳条件占据重要地位。目的:探讨不同电穿孔条件对脐带华通胶间充质干细胞转染率的影响,以确定最佳电转染条件。方法:通过控制电压、脉冲时长及细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒EEV-EGFP转入脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测转染率。结果与结论:(1)电压自125 V至150 V,转染率呈现递增趋势,150 V时获得最大转染率,但将电压进一步调高至170 V,转染率开始显著降低;(2)脉冲时长为5.0 ms时获得最大转染率;脉冲时长为2.5 ms和7.5 ms时转染效率均有所降低;(3)与低氧培养比较,正常培养的细胞转染率更高;(4)结果表明,正常培养的脐带华通胶间充质干细胞在电压150 V、脉冲时长5.0 ms、脉冲间隔时间50 ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率。
  • 【期刊】 电穿孔法高效转染脑胶质瘤细胞U251的条件优化研究

    刊名:内蒙古医学杂志 作者:牛丽丽 ; 王秀娟 ; 张传领 ; 温建勋 ; 姜丽丽 ; 王忆霄 ; 王叶庭 ; 肖瑞 关键词:电穿孔 ; 转染 ; 绿色荧光蛋白 ; 脑胶质瘤细胞 机构:内蒙古医科大学分子病理学重点实验室 ; 内蒙古医科大学分子病理学重点实验室 ; 内蒙古妇幼保健院 年份:2016
    摘要:目的探讨不同电穿孔条件对脑胶质瘤细胞U251电转染率的影响,旨在优化脑胶质瘤细胞U251的电穿孔转染条件以获得较高转染效率。方法以脑胶质瘤细胞系U251为研究对象,在300μl电转体系中,选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量,将pEGFP-C1质粒导入U251,计算转染效率。结果在110V、脉冲250μs、细胞浓度1×106/ml、质粒2μg,转染效果最佳,转染后48 h阳性率约为69%。结论优化条件后的电穿孔法操作简单,经济省时,可用于脂质体等方法较难转染细胞(如脑胶质瘤细胞)的外源基因导入。该实验也为进一步研究其他基因转移到胶质瘤细胞的应用提供可靠的试验参数基础。
  • 【期刊】 活体电穿孔法辅助HFA基因免疫小鼠制备单克隆抗体

    刊名:细胞与分子免疫学杂志 作者:栾好飞 ; 高新 ; 卞丽红 ; 付洁 ; 邱伟成 ; 董立厚 ; 范礼斌 ; 宋海峰 关键词:卵巢癌 ; HE4 ; 活体电穿孔 ; DNA免疫 ; 杂交瘤 ; 单克隆抗体 机构:安徽医科大学基础医学院 ; 安徽医科大学基础医学院 ; 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 ; 军事医学科学院附属医院妇科 年份:2010
    摘要:目的:采用电穿孔辅助DNA免疫方法制备小鼠抗人附睾蛋白4(HFA)单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行鉴定。方法:利用逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)从卵巢癌患者组织中获得人HFA基因编码序列,将其亚克隆至pPICZαA表达载体中并测序鉴定。采用活体电穿孔法免疫BALB/c小鼠。单抗制备采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人HFAmAb的杂交瘤细胞株。采用Westernblot,Ig亚型分析和mAb表位分析等对mAb的生物学特性进行鉴定。结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人I-IFAmAb的杂交瘤细胞株,命名为1—7-C和3-12-C。ELISA和Westernblot结果均显示本实验获得的2株mAb能够特异识别有天然构象的HFA蛋白,2株mAb的Ig亚类均为IgM,轻链均为入链。结论:成功地构建了pPICZαA-HE4表达载体,并获得2株鼠抗人HFA杂交瘤,其所分泌的抗体能特异地识别HFA蛋白。
  • 【期刊】 活体电穿孔法辅助HE4基因免疫小鼠制备单克隆抗体

    刊名:细胞与分子免疫学杂志 作者:栾好飞 ; 高新 ; 卞丽红 ; 付洁 ; 邱伟成 ; 董立厚 ; 范礼斌 ; 宋海峰 关键词:卵巢癌 ; HE4 ; 活体电穿孔 ; DNA免疫 ; 杂交瘤 ; 单克隆抗体 机构:安徽医科大学基础医学院 ; 安徽医科大学基础医学院 ; 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 ; 军事医学科学院附属医院妇科 年份:2010
    摘要:目的:采用电穿孔辅助DNA免疫方法制备小鼠抗人附睾蛋白4(HE4)单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行鉴定。方法:利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从卵巢癌患者组织中获得人HE4基因编码序列,将其亚克隆至pPICZαA表达载体中并测序鉴定。采用活体电穿孔法免疫BALB/c小鼠。单抗制备采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人HE4mAb的杂交瘤细胞株。采用Westernblot,Ig亚型分析和mAb表位分析等对mAb的生物学特性进行鉴定。结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人HE4mAb的杂交瘤细胞株,命名为1-7-C和3-12-C。ELISA和Westernblot结果均显示本实验获得的2株mAb能够特异识别有天然构象的HE4蛋白,2株mAb的Ig亚类均为IgM,轻链均为λ链。结论:成功地构建了pPICZαA-HE4表达载体,并获得2株鼠抗人HE4杂交瘤,其所分泌的抗体能特异地识别HE4蛋白。