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  • 【期刊】 铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定

    刊名:生物技术 作者:段相林 ; 柳彩芝 ; 苗青 ; 薛建奇 ; 潘书红 ; 樊玉梅 关键词:铁蛋白重链 ; 亚铁氧化酶活性 ; 重叠PCR ; 分子克隆 机构:河北师范大学生命科学学院 ; 河北师范大学生命科学学院 年份:2015
    摘要:[目的]构建小鼠铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)亚铁氧化酶活性突变基因的真核表达载体。[方法]针对小鼠FTH基因的亚铁氧化酶活性关键位点(K86、E62和H65),设计并合成6条PCR引物。利用重叠延伸PCR技术,获得小鼠FTH基因的突变体m FTH(K86Q、E62K和H65G),简写为m FTH(3M)。然后将m FTH(3M)插入到实验室已有的C端带Flag标签的真核表达载体pc DNA3中,插入位置为多克隆位点区域中限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ之间,从而得到亚铁氧化酶活性缺失的FTH真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,用脂质体lipofectamineTM2000将其转染到RAW264.7细胞中,检测细胞中带有Flag标签的m FTH(3M)蛋白的表达。[结果]重组质粒酶切得到预期片段,测序显示所构建的m FTH(3M)真核表达载体序列正确,细胞内检测到带Flag标签的m FTH(3M)蛋白信号的强烈表达。[结论]实验成功构建了小鼠FTH亚铁氧化酶活性位点基因突变的真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。
  • 【期刊】 脂多糖对巨噬细胞铁代谢的影响

    刊名:解剖学报 作者:段相林 ; 王莉 ; 姜宝华 ; 钱忠明 关键词:二价金属离子转运体 ; 金属转运蛋白 ; 原代培养 ; 巨噬细胞 ; 小鼠 机构:河北师范大学生命科学学院分子神经生物学与神经药理学研究所 ; 河北师范大学生命科学学院分子神经生物学与神经药理学研究所 ; 河北科技大学生物科学与工程学院 ; 河北政法职业学院公共基础部 ; 香港理工大学应用生物及化学科技学系 年份:2014
    摘要:目的检测二价金属离子转运体(DMT1)和金属转运蛋白(FPN1)在原代培养巨噬细胞中的分布及脂多糖(LPS)对巨噬细胞铁代谢的影响。方法采用原代细胞培养、MTT显色、细胞化学染色和细胞免疫荧光等方法检测LPS对原代培养的巨噬细胞活性的作用及对DMT1和FPN1分布的影响。结果不带铁反应元件的二价金属离子转运体(DMT1-IRE)主要在细胞核中表达,在细胞质中分布较少。带铁反应元件的二价金属离子转运体(DMT1+IRE)主要分布于细胞质中,可以将吞噬小体中的铁向细胞质中转运。FPN1在巨噬细胞的细胞质和细胞膜均有表达,但主要分布于细胞质。结论巨噬细胞吞噬衰老的红细胞以后,其中的亚铁血红素在细胞质中分解,FPN1可能介导了亚铁血红素分解释放出来的铁在巨噬细胞质中的转运过程。LPS在低浓度时有促进巨噬细胞生长的作用,LPS浓度为10-5μg/L时达到高峰,随着浓度的增加,又开始抑制细胞生长。
  • 【期刊】 线粒体未折叠蛋白反应分子机制的研究进展

    刊名:生物化学与生物物理进展 作者:段相林 ; 樊玉梅 ; 郝强 ; 刘思颖 ; 常彦忠 ; 谭克 关键词:线粒体 ; 线粒体未折叠蛋白反应 ; ATFS-1 ; HSF1 ; ATF5 ; 疾病 机构:河北师范大学生命科学学院河北省动物生理生化与分子生物学重点实验室 ; 河北师范大学生命科学学院河北省动物生理生化与分子生物学重点实验室 年份:2017
    摘要:线粒体未折叠蛋白反应(UPR~(mt))作为新发现的细胞内应激机制,直接影响老化、神经退行性疾病、癌症等疾病的发生发展.UPR~(mt)是线粒体为了维持其内部蛋白质的平衡,启动由核DNA编码的线粒体热休克蛋白和蛋白酶等基因群转录活化程序的应激反应.深入探究UPR~(mt)的作用机制对阐明老化和线粒体相关疾病的发病机理具有指导意义.本文主要阐述了线粒体未折叠蛋白反应的诱导因素、线虫和哺乳动物细胞中最新的未折叠蛋白应激反应的信号传导通路、调控因子、具体作用机制以及线粒体未折叠蛋白反应与衰老、免疫等疾病的联系,旨在为这些疾病提供新的理论基础和治疗靶点.
  • 【期刊】 铁蛋白轻链真核表达载体的构建

    刊名:生物技术 作者:段相林 ; 张洁 ; 张永泽 ; 柳彩芝 ; 樊玉梅 关键词:铁蛋白轻链 ; RAW264.7 ; pcDNA3 ; 分子克隆 ; 免疫印迹 机构:河北师范大学生命科学院 ; 河北师范大学生命科学院 年份:2014
    摘要:目的:为进一步研究铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的表达对细胞内信号转导途径的影响提供平台。方法:利用PCR扩增技术得到小鼠552 bp的FTL基因编码序列,并在基因的C端引入Flag标签,将此序列插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点区域中限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ之间,得到带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。分别经酶切和测序鉴定。用脂质体lipofectamineTM2000将构建成功的pcDNA3-FTL-Flag及其对照空载体pcDNA3分别转染到RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用Western blot方法检测细胞中带有Flag标签的FTL蛋白表达。结果:重组质粒酶切鉴定得到预期片段,测序结果显示所构建的小鼠FTL基因的cDNA序列正确,并在细胞内检测到分子量约为21kDa的蛋白的强烈表达信号。结论:实验成功构建小鼠FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。
  • 【期刊】 小鼠铁调素1功能肽Hepc25的表达及纯化

    刊名:解剖学报 作者:段相林 ; 赵述强 ; 石振华 ; 栗海峰 ; 常彦忠 关键词:Hepcidin1 ; Hepc25 ; 铁代谢 ; 融合蛋白 ; SDS-PAGE ; 层析 ; 免疫印迹法 ; 小鼠 机构:河北师范大学生命科学学院铁代谢分子生物学实验室 ; 河北师范大学生命科学学院铁代谢分子生物学实验室 年份:2012
    摘要:目的利用原核生物表达载体表达小鼠铁调素功能肽Hepc25,并对其进行纯化。方法选取编码25aa的Hepc25基因与硫氧还蛋白基因融合后在大肠杆菌中大规模诱导表达该融合蛋白,以RT-PCR法扩增小鼠Hepcidin1功能肽基因Hepc25,将目的基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中获得pET-32a-Hepc25,再以pET-32a-Hepc25转化大肠杆菌BL21表达融合蛋白,收集菌体蛋白,用Western blotting和SDS-PAGE法检测融合蛋白,优化融合蛋白高表达条件。依次利用亲和层析、离子交换层析和凝胶排阻层析法纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切、高效液相色谱法(HPLC)分离纯化获得了目的蛋白Hepc25。结果成功构建了小鼠pET-32a-Hepc25融合蛋白表达载体,融合蛋白表达量约占大肠杆菌BL21总蛋白量的28%,融合蛋白在33℃、120r/min、终浓度为0.2mmol/L的异丙基-β-D硫化半乳庶糖(IPTG)诱导8h的条件下表达量最高,融合蛋白纯度达95%。融合蛋白经过色谱分离、酶切和HPLC分析,目的蛋白的纯度也达95%以上。结论利用原核生物表达载体成功表达并纯化了小鼠铁调素功能肽Hepc25,并筛选出了高表达的优化条件。
  • 【期刊】 FTL-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其表达

    刊名:生物技术 作者:段相林 ; 徐慕陶 ; 何淑芬 ; 苗峻华 ; 刘思颖 ; 谭克 ; 樊玉梅 关键词:铁蛋白轻链 ; 绿色荧光蛋白 ; 分子克隆 ; 免疫印迹 机构:河北师范大学生命科学学院 ; 河北师范大学生命科学学院 年份:2017
    摘要:[目的]构建小鼠铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)真核表达载体并检测其表达。[方法]利用PCR扩增技术得到小鼠560 bp的FTL基因编码序列,将此序列插入到含有增强型绿色荧光基因EGFP的真核表达载体PEGFP/N1多克隆位点区域中的限制内切酶HindⅢ和Bam HⅠ之间,得到真核表达载体m FTL-PEGFP/N1。经酶切和测序鉴定后,将构建成功的m FTL-PEGFP/N1及其对照空载体PEGFP/N1分别转染到小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用免疫印迹技术检测细胞中带有PEGFP标签的FTL蛋白的表达。[结果]新构建的m FTL-PEGFP/N1重组质粒经酶切鉴定得到预期片段,进一步的测序结果显示所构建的重组质粒中插入的小鼠FTL基因的c DNA序列正确。[结论]利用分子克隆技术获得了带有绿色荧光蛋白标签的小鼠铁蛋白轻链真核表达载体m FTL-PEGFP/N1,并在细胞中表达良好。
  • 【期刊】 组蛋白去甲基化酶PHD锌指蛋白8与神经发育

    刊名:生物化学与生物物理进展 作者:段相林 ; 郭晓强 ; 沈永青 ; 刘贝 ; 常彦忠 关键词:组蛋白去甲基化酶 ; PHD锌指蛋白8 ; X-连锁智力迟滞 ; 神经发育 机构:河北师范大学生命科学学院铁代谢分子生物学研究室 ; 河北师范大学生命科学学院铁代谢分子生物学研究室 ; 解放军白求恩军医学院生化教研室 ; 北京大学深圳医院男性生殖与遗传广东省重点实验室 年份:2011
    摘要:PHD锌指蛋白8(PHF8)是一种Fe2+和α-酮戊二酸依赖的组蛋白赖氨酸去甲基化酶.PHF8属于包含JmjC结构域蛋白家族,在N端还含有一个PHD(planthomeodomain)锌指结构域.人的PHF8基因突变往往破坏组蛋白去甲基化酶活性,从而引发遗传性X-连锁智力迟滞(XLMR)并伴发唇裂的发生.PHF8一方面可催化H3K9me2/1、H4K20me1和H3K27me2的去甲基化,另一方面还通过N端PHD锌指结构域与H3K4me3结合而发挥转录共激活作用.PHF8可调节rRNA和多个涉及神经发育的蛋白质编码基因如JARID1C的表达.这些研究显示,PHF8是一种重要的神经发育调节因子,从而拓宽了对组蛋白甲基化与基因表达关联的理解,同时为XLMR疾病的理解提供了新的线索.
  • 【期刊】 靶向FTL基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

    刊名:生物技术 作者:段相林 ; 蔡琳琳 ; 柳彩芝 ; 黄永茂 ; 王胜南 ; 樊玉梅 关键词:FTL基因 ; RNA干扰 ; shRNA ; 真核表达载体 机构:河北师范大学生命科学院 ; 河北师范大学生命科学院 ; 河北化工医药职业技术学院化学与环境工程系 年份:2014
    摘要:目的:为了构建铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的短发夹小干扰RNA表达载体,并提供进一步研究FTL功能的平台。方法:针对小鼠FTL基因的特异性位点设计并合成特异性长度约65bp的短发夹状小干涉RNA(shRNA)寡核苷酸序列,退火形成双链后将其插入真核表达载体pRNA-U6.1/neo的限制性内切酶HindⅢ和Bam HⅠ之间中,构建成FTL基因的干扰载体(FTL shRNA)。经测序鉴定正确后,用lipofectamineTM2000将FTL shRNA及其对照空载体pRNA-U6.1/neo分别转染到小鼠腹腔单核巨噬细胞(RAW264.7)中,提取蛋白后利用Western blot技术检测细胞中FTL蛋白的表达。结果:得到与预期目的片段大小相似的重组载体,测序结果显示所构建的小鼠FTL shRNA质粒序列正确。细胞内的FTL表达被FTL shRNA成功干扰,效率高达80%。结论:实验成功构建了小鼠FTL基因的短发夹小RNA干扰表达载体FTL shRNA。
  • 【期刊】 血红素铁的肠铁吸收及调控机制研究进展

    刊名:中国科学:生命科学 作者:段相林 ; 耿丽娜 ; 李亚永 ; 于鹏 ; 常彦忠 关键词:血红素铁 ; 铁摄取 ; 铁转运 ; 铁代谢 机构:河北师范大学化学与材料科学学院 ; 河北师范大学化学与材料科学学院 ; 河北师范大学生命科学学院铁代谢分子生物学研究室 ; 石家庄市第九医院内科 年份:2012
    摘要:肠铁吸收及调节机制是机体维持铁稳态的关键环节.对非血红素铁的吸收及调控机制研究较多,而对血红素铁的报道较少,对其吸收及调控机制还需深入研究.本文依据最新的研究进展,介绍了血红素铁的肠铁吸收途径及其调控机制,希望对预防和治疗铁代谢相关疾病提供基础资料.
  • 【期刊】 辣椒红色素与辣椒素生物技术提取与分离工艺研究

    刊名:河北师范大学学报(自然科学版) 作者:段相林 ; 葛兰 ; 付权习 ; 陈伟斌 ; 陈德龙 ; 贾素桥 ; 胡相振 ; 常彦忠 关键词:辣椒素 ; 辣椒红色素 ; 同步提取 机构:河北师范大学生物制药研究中心 ; 河北师范大学生物制药研究中心 ; 河北华田食品有限公司 年份:2011
    摘要:利用辣椒素和辣椒红色素在不同体积分数乙醇中的溶解度差异,建立一次性提取及纯化辣椒中辣椒素和辣椒红色素的方法.经过不断的摸索和尝试,最终确立乙醇超声提取法一次性提取辣椒中的辣椒素和辣椒红色素,并对其制备条件进行优化.经试验验证,辣椒素最佳的乙醇提取体积分数为550 mL/L,最佳的提取次数为5次,最佳的提取温度为70℃;辣椒红色素最佳的乙醇提取体积分数为950 mL/L,最佳的提取次数为3次,最佳的提取温度为50℃.
  • 【期刊】 高铁对大鼠大脑皮层二价金属转运蛋白1表达的影响

    刊名:解剖学报 作者:段相林 ; 于鹏 ; 张明 ; 崔瑞 ; 苗巍 ; 王书敏 ; 常彦忠 关键词:大脑皮层 ; ; 二价金属转运蛋白1 ; 免疫组织化学 ; 大鼠 机构:河北师范大学分子神经生物学与神经药理学研究所河北省动物生理生化与分子生物学重点实验室 ; 河北师范大学分子神经生物学与神经药理学研究所河北省动物生理生化与分子生物学重点实验室 年份:2011
    摘要:目的探讨在脑铁代谢中发挥重要生理作用的二价金属转运蛋白1(DMT1)的表达及其调控机制。方法大鼠(n=6)侧脑室注射右旋糖酐铁3d和7d后,采用铁组织化学法检测脑内铁含量的变化,免疫组织化学技术检测大脑皮层中DMT1的两种亚型,即DMT1(+IRE)和DMT1(-IRE)蛋白表达的变化。结果铁组织化学染色结果显示,大鼠侧脑室注射右旋糖酐铁500μg/(只.d)7d后,大脑皮层中二价铁和三价铁均显著增高。同时,免疫组织化学结果表明,与对照组相比,脑内达高铁状态时大脑皮层DMT1(+IRE)蛋白表达显著升高,而DMT1(-IRE)蛋白表达无显著变化。结论在大鼠大脑皮层中,DMT1(+IRE)蛋白对铁水平的升高更为敏感,其表达与脑铁水平(尤其是二价铁)呈正相关。高铁对脑内不同区域内不同亚型DMT1表达的影响存在特异性。
  • 【期刊】 单核巨噬细胞铁代谢相关蛋白的表达调控

    刊名:生物物理学报 作者:段相林 ; 孔卫娜 ; 张彩云 ; 常彦忠 关键词:单核巨噬细胞系统 ; 铁调素 ; 血红素加氧酶 ; 铁蛋白 ; 膜铁转运蛋白1 机构:河北师范大学铁代谢分子生物学研究室 ; 河北师范大学铁代谢分子生物学研究室 ; 河北化工医药职业技术学院 年份:2010
    摘要:人类机体的铁代谢表现为受限制的对外界铁的吸收和有效的机体内的铁的再循环利用,单核巨噬细胞系统通过吞噬衰老的红细胞,储存和释放铁,在机体铁的循环再利用方面起到了重要的作用。因此,单核巨噬细胞系统对整个机体铁稳态的维持非常重要。近年来,随着转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TfR1)、铁蛋白(ferritin,Fn)、二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter1,DMT1)、膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1),以及铁调素(hepcidin)等在单核巨噬细胞系统中功能和调控机制研究的不断深入,日益加深了人们对单核巨噬细胞系统的铁代谢过程和调控机制的了解。该文综述了铁水平、NO以及炎症等因素对单核巨噬细胞系统TfR1、Fn、DMT1、FPN1、hepcidin等蛋白表达的调控及其机制研究的最新进展。