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  • 【期刊】 miR-30c过表达对斑马鱼早期心脏发育的影响

    刊名:中华实用儿科临床杂志 作者:朱金改 ; 徐晶 ; 李萌萌 ; 刘雪华 ; 余章斌 ; 朱春 ; 韩树萍 ; 胡晓山 关键词:miR-30c 斑马鱼 心脏发育 机构:南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 年份:2016
    摘要:目的探究miR-30c过表达对斑马鱼早期心脏发育的影响。方法于斑马鱼胚胎1细胞受精卵期,显微注射3个不同浓度梯度的miR-30c模拟物以实现过表达。通过计数在不同时间点斑马鱼胚胎的病死率及心率、显微镜观察斑马鱼大体形态及心包水肿情况,以及胚胎整体原位杂交等方法,评价miR-30c过表达对斑马鱼早期心脏发育的影响。结果与野生型对照组比较,随着过表达浓度的提高,斑马鱼胚胎的病死率逐渐增高,至8μmol/L浓度时,斑马鱼受精后96h病死率已达80%。而同时,作为评价心脏功能重要指标的心率逐渐下降。此外,随着过表达浓度的递增,斑马鱼心包水肿的程度越来越高,且此种心包水肿随着时间的推移越来越严重。之后,通过胚胎整体原位杂交的方法,观察心脏部位特异性基因的表达,发现过表达miR-30c的斑马鱼中,标记心房肌及心室肌探针的表达范围都有所扩大,心脏环化受到抑制,且心脏房室通道瓣膜处的基因表达缺失。结论miR-30c过表达影响斑马鱼的早期心脏发育。
  • 【期刊】 miR-20b过表达对P19细胞增殖和细胞分化的影响

    刊名:发育医学电子杂志 作者:朱金改 ; 朱莎莎 ; 刘雪华 ; 余章斌 ; 朱春 ; 李萌萌 ; 韩树萍 ; 胡晓山 ; 彭宇竹 关键词:P19细胞 ; miR-20b ; 细胞增殖 ; 心肌分化 机构:南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 年份:2014
    摘要:目的探讨miR-20b过表达对P19细胞增殖和细胞分化的影响。方法将包含鼠miR-20b成熟序列的慢病毒载体及空载体分别感染P19细胞,通过嘌呤霉素筛选2周,建立稳定过表达鼠mR-20b的P19细胞系。用Real-time PCR的方法验证稳定细胞表达株。用CCK-8方法检测稳定感染miR-20b过表达慢病毒和空载体的P19细胞间细胞增殖的差别。将稳定感染的两组细胞以无血清培养液37℃孵育24小时使细胞停留于G0期,而后恢复血清培养,取不同时间点的细胞,使用流式细胞仪检测两组间细胞周期的差别,从而间接验证CCK-8的结果。以1%二甲基亚砜(DMSO)将两组稳定感染的P19细胞诱导分化为心肌细胞,Real-time PCR检测心肌分化相关标志基因的表达,并用光镜观察分化过程中的形态变化。结果建立了稳定表达miR-20b的P19细胞系,与空载体组相比,miR-20b过表达可抑制P19细胞的增殖,促进心肌分化相关标志基因的表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。结论 miR-20b过表达可显著抑制P19细胞的增殖,并具有促进P19细胞向心肌细胞分化的作用。
  • 【期刊】 NYGGF4基因表达沉默对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响

    刊名:实用儿科临床杂志 作者:朱金改 ; 史春梅 ; 季晨博 ; 张春梅 ; 陈玲 ; 郭锡熔 关键词:NYGGF4基因 ; 线粒体 ; 线粒体代谢 ; 3T3-L1脂肪细胞 机构:南京医科大学附属南京妇幼保健院儿童保健科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿童保健科 ; 南京医科大学儿科研究所 年份:2012
    摘要:目的探讨NYGGF4(又称PID1)基因沉默对脂肪细胞线粒体代谢的影响。方法以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4基因沉默载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA,NYGGF4-RNAi)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体(pG-PU6/GFP/Neo-shRNA,NC shRNA)的3T3-L1前体脂肪细胞作为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用实时定量RCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体代谢酶指标:己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平。结果 NYGGF4表达沉默与NYGGF4基因过表达相比,可以部分逆转3T3-L1脂肪细胞中己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异均有统计学意义。结论NYGGF4基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4基因的动态平衡对维持3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢具有重要作用。
  • 【期刊】 邻苯二甲酸二乙基己酯对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性

    刊名:中华实用儿科临床杂志 作者:朱金改 ; 李萌萌 ; 余章斌 ; 韩树萍 ; 胡晓山 ; 朱莎莎 ; 朱春 ; 郭锡熔 关键词:斑马鱼 ; 邻苯二甲酸二乙基己酯 ; 心脏发育 ; 胚胎毒性 机构:南京医科大学附属南京市妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学附属南京市妇幼保健院儿科 年份:2013
    摘要:目的 探讨环境污染物邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性及其机制.方法 采用水域染毒法,将受精后4 h(4 hpf)的斑马鱼胚胎分别暴露于质量浓度为1、2、4、8 mg/L的DEHP作为4个质量浓度组,同时设79.2 mg/L甲醇对照组、60 mg/L的氯化钠溶液空白对照组.通过分析72 hpf的孵化率,24、48、72、96、120 hpf的死亡率和畸形率等指标以及胚胎整体原位杂交的方法来评价DEHP对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性.结果 与对照组比较,随着DEHP质量浓度的增加,斑马鱼胚胎72 hpf的孵化率降低,24、48、72、96、120 hpf的死亡率和畸形率增加.当DEHP质量浓度达到8 mg/L时,斑马鱼72 hpf的孵出率由对照组的98.33%下降到62.22%,并且120 hpf的死亡率达40.00%、畸形率达27.30%.整体原位杂交结果显示DEHP处理组斑马鱼胚胎心脏的位置和心管环化均出现不同程度的异常.与对照组比较,DEHP处理组胚胎在24 hpf心房肌球蛋白重链(amhc)、心室肌球蛋白重链(vmhc)、心肌肌浆球蛋白轻链(cmlc2)的表达位置均发生了变化;48 hpf amhc的表达量明显下降,vmhc的表达位置发生了变化,cmlc2标志的整个心脏发育异常,未能完成心脏环化过程,仅形成1条心管.结论 DEHP能影响斑马鱼胚胎发育,导致斑马鱼胚胎和幼鱼的畸形与死亡,而它的心脏毒性可能发生在心管的环化过程中.
  • 【期刊】 STEAP4蛋白在人脂肪组织中表达大小的验证

    刊名:实用儿科临床杂志 作者:朱金改 ; 邱洁 ; 周晓玉 ; 程锐 ; 王玢 ; 朱春 ; 郭锡熔 关键词:肥胖 ; STEAP4蛋白 ; 表达 机构:南京医科大学附属南京儿童医院新生儿科 ; 南京医科大学附属南京儿童医院新生儿科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 年份:2010
    摘要:目的采用STEAP4多克隆抗体对其在人脂肪组织中的表达大小进行验证。方法 6例阑尾炎手术患儿中随机选取3例患儿的脂肪组织标本,抽提总蛋白,应用本实验室自制的STEAPG蛋白多克隆抗体,采用Westernblot技术检测STEAP4蛋白在人脂肪组织中表达的大小。结果目的条带出现于蛋白Marker相对分子质量55000以下位置,与STEAP4蛋白预测相对分子质量52000基本相符。结论本实验室自制的STEAP4蛋白多克隆抗体具有良好的免疫学活性,能够满足STEAP4免疫印迹检测的实验要求。STEAP4蛋白在人脂肪组织中的相对分子质量约为52000,为后续深入研究STEAP4蛋白的功能奠定了基础。
  • 【期刊】 miR-19b 沉默对 P19细胞分化及线粒体功能的影响

    刊名:《东南大学学报:医学版》 作者:朱金改 ; 刘雪华 ; 朱莎莎 ; 余章斌 ; 朱春 ; 李萌萌 ; 韩树萍 ; 胡晓山 ; 彭宇竹 关键词:微小RNA-19b沉默 ; P19细胞 ; 线粒体 ; 分化 机构:南京医科大学 ; 南京医科大学 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 年份:2015
    摘要:目的:通过沉默微小RNA-19b( miR-19b)研究miR-19b对P19细胞分化及线粒体功能的影响。方法:转染miR-19 b沉默质粒与空载质粒进入P19细胞建立起稳定的细胞系;线粒体功能分析用以检测细胞凋亡;诱导分化 P19细胞,实时定量荧光 PCR 检测 miR-19 b 沉默后细胞分化关键基因表达水平。结果:TargetScan 5.1软件及双荧光素酶报告基因系统共同证实,Wnt1为miR-19b在P19细胞中发挥作用的靶点( P<0.05);测定第0、4、6、8、10、12天cTnT、NKX2.5、GATA4等基因的核酸表达量显示,心肌分化相关标志基因逐渐增高,miR-19 b沉默组明显低于对照组( P<0.05);于分化第10天检测线粒体功能,发现miR-19 b沉默组线粒体DNA拷贝数的相对含量高于对照组,其活性氧水平显著低于对照组,ATP水平也高于对照组(均P<0.05)。结论:miR-19b沉默可抑制细胞凋亡,抑制心肌细胞分化。
  • 【期刊】 Leptin对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调控

    刊名:南京医科大学学报(自然科学版) 作者:朱金改 ; 赵亚萍 ; 张春梅 ; 陈小慧 ; 高春林 ; 朱春 ; 郭锡熔 关键词:人前体脂肪细胞 ; 诱导分化 ; NYGGF4基因 ; leptin 机构:南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 ; 中国人民解放军第82医院内分泌科 ; 南京医科大学儿科医学研究所 年份:2009
    摘要:目的:观察leptin对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调节作用。方法:体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用100ng/ml人重组leptin分别干预成熟脂肪细胞6、24h,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测成熟脂肪细胞中NYGGF4基因mRNA的表达水平。结果:100ng/ml leptin干预人成熟脂肪细胞6h后,NYGGF4基因mRNA的相对表达量为0.000476±0.000178,显著低于对照组0.00114±0.000275,P<0.05;干预24h NYGGF4基因mRNA的相对表达量为0.000835±0.000211,也显著低于对照组0.001419±0.000193,P<0.05。结论:leptin能显著下调成熟脂肪细胞中NYGGF4基因的表达。
  • 【期刊】 STEAP4基因在人前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达

    刊名:实用儿科临床杂志 作者:朱金改 ; 陈小慧 ; 赵亚萍 ; 高春林 ; 张春梅 ; 朱春 ; 郭锡熔 关键词:STEAP4基因 ; 人前体脂肪细胞 ; 分化 机构:南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学儿科医学研究所 ; 中国人民解放军第82医院内分泌科 年份:2010
    摘要:目的观察人肥胖相关全长新基因STEAP4在人前体脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨STEAP4基因与脂肪细胞分化、脂质积聚的关系。方法体外培养人前体脂肪细胞,待细胞生长融合后以1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及罗格列酮联合诱导方案,在体外诱导其分化为成熟脂肪细胞。在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中观察细胞形态及脂质积聚变化;采用实时荧光定量RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(前体,第0、4、6、8、11、14、17天)脂肪细胞中STEAP4基因mRNA的表达水平。结果STEAP4基因高表达于人前体脂肪细胞;加入脂肪细胞分化诱导剂后(第4天)表达略有上调,其后随脂肪细胞分化成熟该基因表达量呈逐渐下降趋势;至脂肪细胞完全分化成熟(第14-17天)表达量最低。STEAP4基因表达水平除在诱导分化前至第4天、第14-17天差异无统计学意义外,余各时间点的表达水平差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论STEAP4基因随脂肪细胞分化成熟表达逐渐下调,可促进脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖的发生有关。
  • 【期刊】 TNMD基因在肥胖者脂肪组织中的表达及生物信息学分析

    刊名:江苏医药 作者:朱金改 ; 程锐 ; 邱洁 ; 赵亚萍 ; 陈小慧 ; 高春林 ; 张春梅 ; 郭锡熔 关键词:肥胖 ; 差异表达基因 机构:南京医科大学附属南京儿童医院 ; 南京医科大学附属南京儿童医院 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院 年份:2010
    摘要:目的验证差异表达基因-Tenomodulin(TNMD)基因在肥胖者脂肪组织中的表达及生物信息学特征。方法采用实时荧光定量RT-PCR法验证肥胖与正常人(各8例)脂肪组织中TNMD基因的表达差异,应用生物信息学方法初步分析该基因的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构域、亚细胞定位及结构域等。结果TNMD基因差异低丰度表达于肥胖者脂肪组织中。该基因cDNA全长1360bp,开放阅读框长954bp,编码317个氨基酸,预测分子量37kDa,定位于染色体Xq21.33-q23区带,含7个外显子和6个内含子;其编码蛋白为一非分泌的跨膜蛋白,定位于线粒体的可能性较大,存在一BRICHOS结构域。结论成功验证TNMD基因在肥胖与正常者脂肪组织中的差异表达并对其进行生物信息学分析,为进一步研究该基因提供依据。
  • 【期刊】 miR-19b转基因小鼠的构建及表型分析

    刊名:南京医科大学学报(自然科学版) 作者:朱金改 ; 胡晓山 ; 余章斌 ; 李萌萌 ; 朱春 ; 韩树萍 关键词:转基因小鼠 ; 心脏肥大 ; miR-19b ; 心血管疾病 机构:南京医科大学附属南京市妇幼保健院儿科 ; 南京医科大学附属南京市妇幼保健院儿科 年份:2013
    摘要:目的:构建心肌细胞特异性过表达miR-19b的转基因小鼠,并对其进行表型分析。方法:先确定载体插入的酶切位点,根据CloneEZRPCR Cloning Kit重组原理设计相应引物,以小鼠基因组为模板克隆出带有miR-19b前体序列(pre-miR-19b)的目的片段,利用重组酶连接到带有alpha-MHC启动子的载体上。将所得载体线性化后,采用显微注射方法注射到小鼠胚胎干细胞内。再将所得的重组胚胎干细胞移植入假孕的C57BL/6J雌鼠子宫内,在所得的子代,即Founder小鼠中采用特异的引物鉴定出转基因小鼠,并选出相应的品系,进行表型分析。结果:成功构建miR-19b转基因小鼠,且miR-19b转基因小鼠舒张期室间隔厚度、舒张期左室游离壁厚度以及射血分数均有升高。结论:心肌特异性过表达miR-19b可以导致心脏肥大。
  • 【期刊】 NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响

    刊名:中国儿童保健杂志 作者:朱金改 ; 史春梅 ; 季晨博 ; 张春梅 ; 陈玲 ; 郭锡熔 关键词:NYGGF4基因 ; 线粒体 ; 线粒体代谢 ; 3T3-L1脂肪细胞 机构:南京医科大学附属南京妇幼保健院儿童保健科 ; 南京医科大学附属南京妇幼保健院儿童保健科 ; 南京医科大学儿科研究所 年份:2012
    摘要:【目的】观察NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响。【方法】以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4(PID1)基因(NYGGF4-pcDNA3.1(+)/myc-His B)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体[pcDNA3.1(+)/myc-His B]的3T3-L1前体脂肪细胞为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤(MIX)加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用Real-time PCR检测线粒体代谢酶指标:己糖激酶(Hexokinase,HKI)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA,ACC)、柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(Carnitine palmitoyl-transferase 1,CPT1)、细胞色素C(Cytochrome c,Cyc-c)基因表达水平。【结果】NYGGF4(PID1)过表达显著降低3T3-L1脂肪细胞己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异有统计学意义。【结论】NYGGF4(PID1)基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4(PID1)基因过表达能影响3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢。
  • 【期刊】 miR-20b慢病毒表达载体的构建及表达

    刊名:江苏医药 作者:朱金改 ; 朱莎莎 ; 朱春 ; 余章斌 ; 韩树萍 ; 彭宇竹 关键词:miR-20b ; 慢病毒 ; P19细胞 机构:南京医科大学 ; 南京医科大学 ; 南京医科大学附属南京市妇幼保健院儿科 年份:2014
    摘要:目的构建鼠miR-20b慢病毒表达载体,检测其在P19细胞中的过表达效果。方法设计并合成含有miR-20b成熟序列的编码短发卡状RNA(shRNA)的双链DNA。将shRNA克隆入慢病毒载体,与Pcgvp、Rev和Vsvg包装质粒共转染HEK-293T细胞包装病毒,收取病毒上清液,纯化后感染P19细胞。荧光倒置显微镜下观察感染效率,实时定量PCR检测慢病毒感染后miR-20b的相对表达量。结果经双酶切分析及测序验证,成功构建了miR-20b的过表达载体。慢病毒感染P19细胞的效率可达到70%以上,miR-20b表达水平明显升高。结论成功构建了鼠miR-20b的慢病毒表达载体,包被的病毒可以在P19细胞中实现过表达效果。
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