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  • 【期刊】 原核细胞精氨酸生物合成途径的研究进展

    刊名:生物技术通报 作者:闫洪波 ; 王威 ; 李令娣 ; 安万昌 关键词:精氨酸 ; 乙酰谷氨酸合成酶 ; 乙酰谷氨酸激酶 ; 鸟氨酸乙酰基转移酶 ; ArgR 机构:滨州生物技术研究院 ; 滨州生物技术研究院 ; 山东民强生物科技股份有限公司 年份:2015
    摘要:原核生物的精氨酸生物合成包含8个酶系,起始于乙酰谷氨酸激酶催化的谷氨酸的乙酰化。到第五步乙酰基团脱离,乙酰谷氨酸通过3个酶的作用,进一步合成乙酰化中间产物。鸟氨酸被氨甲酰基化生成瓜氨酸,天冬氨酸介入后形成精氨琥珀酸,最后形成终产物精氨酸。主要就精氨酸生物合成途径、合成过程中主要酶系及反馈抑制蛋白的作用机制进行了概述。此外,提出了目前精氨酸代谢研究中存在的问题及未来的研究方向。
  • 【期刊】 人白血病抑制因子在原核细胞中的表达与纯化

    刊名:中国生物工程杂志 作者:张鹤铭 ; 蔡楚凡 ; 刘杨 ; 甘龙站 ; 焦雪苗 ; 田永强 关键词:白血病抑制因子 ; 诱导 ; 表达 ; 简单纯化 机构:四川大学轻纺与食品学院 ; 四川大学轻纺与食品学院 ; 生物质与皮革工程系 ; 四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室 ; 河南大学植物逆境生物学重点实验室 年份:2017
    摘要:研究证明人白血病抑制因子(hLIF)是一种对多种不同类型的细胞和组织具有重要功能的细胞因子,其独特的生物学特性使其被广泛应用.介绍了自制的具有生物活性的hLIF,将hLIF基因克隆到pET32a中,并利用硫氧还蛋白(TrX)作为融合配体,在大肠杆菌中成功表达可溶性融合蛋白Trx-hLIF.亲和层析纯化后利用SDS-PAGE和Western blot对纯化结果进行检验.利用肠激酶(EK酶)切割融合蛋白,释放hLIF,随后通过简单的阳离子交换得到纯度高达98.1%的hLIF4.75mg.小鼠M1髓系白血病细胞增殖分析测定纯化的rhLIF的功能与hLIF具有相似的生物活性,EC50为5ng/ml,对应的比活性为0.5×107 IU/mg.
  • 【期刊】 Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

    刊名:中国医药指南 作者:李耀林 ; 周艺 ; 何爱桃 ; 唐双阳 ; 王蓉 ; 万艳平 关键词:Daxx ; 表达 ; 纯化 ; 抗原性 机构:南华大学病原生物学研究所 ; 南华大学病原生物学研究所 ; 南华大学公共卫生学院 ; 南华大学护理学院 年份:2013
    摘要:目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a/DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5.0软件设计Daxx-C基因片段(氨基酸626-740)特异性引物,引入BamHI和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T/DM626-740;然后,将BamHI和SalI酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a/DM626-740。将其转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a/DM626-740;该质粒在E.coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a/DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。
  • 【论文】 抗痛蝎毒素多肽的原核细胞重组表达与功能研究

    作者:冉秋行 关键词:蝎毒素多肽 ; 抗痛 ; 重组表达 ; 细胞调制 ; 钠电流 机构:延安大学 ; 延安大学 年份:2016
    摘要:离子通道是细胞膜上普遍存在的电兴奋分子。蝎毒素可以选择性地与膜上各离子通道相互作用,影响离子通道状态。多属β-类抗痛蝎毒素,能靶向结合在电压门控钠通道第四个位点上,通过电压传感器俘获机制特异性激活电压依赖性钠通道,使钠电流向复极化方向移动。由于天然状态下蝎毒素表达量较少,阻碍围绕蝎毒素相关的细胞膜离子通道的研究。因此本实验通过原核细胞外源表达的方法实现其功能性表达,并采用细胞学方法解析相关钠电流的变化及抗痛效应机制。1.抗痛蝎毒素多肽重组表达体系的构建表达重组蛋白的方法有很多,采用酿酒酵母、毕赤酵母等真核生物表达重组多肽,采用昆虫、哺乳动物细胞表达,原核细胞表达以大肠杆菌为主,容易培养价格低廉,较真核表达有较多优势。因此我们构建了蝎毒素多肽的原核细胞表达体系,使用pET-32a作为表达载体,pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白比较完善的表达系统。采用微生物培养大肠杆菌BL21(DE3)加IPTG诱导表达,逐步缩小时程并优化表达条件,确定初步纯化获得的粗蛋白产量约0.0885g/15ml。采用SDS-PAGE蛋白质电泳,western-blot免疫实验,AKTA蛋白纯化,HPLC色谱,动物实验,全细胞膜片钳记录等方法研究抗痛蝎毒素的细胞机制。(1)阳性重组子的筛选:将BmK-AS、BmK-AS1、BmK-IT2三个毒素基因片段使用BamHⅠ、XhoⅠ这两种限制性内切酶切出粘性末端,用T4 DNA连接酶将载体pET-32a与目的基因连接,转入TOP10菌种中保存,然后采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA,重组质粒比空质粒的分子大,跑电泳后表现出明显重组质粒滞后现象。用带氨苄青霉素抗性的SOB培养基筛选出成功导入的目的基因质粒的大肠杆菌,呈阳性菌株是用于表达毒素多肽的菌种。(2)IPTG诱导重组表达:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)与自然的β-半乳糖苷酶相似,不能被酶分解,性质稳定,是lac基因簇十分有效的诱导物,因此被广泛用在分子生物学与基因工程中。用微生物培养大肠杆菌加IPTG诱导法表达外源蛋白,每隔1小时取一次样,通过溶解、离心、破菌得到不同成分蛋白,电泳检测表达情况,确定各自的优化表达条件BmK-AS 37℃、6h,BmK-AS1 30℃、6h,BmK-IT215℃、8h。(3)重组多肽分离纯化:采用金属镍离子亲和柱和高效液相色谱法对毒素蛋白逐步纯化,色谱结果显示镍离子与三种重组毒素分子表面的亲和作用去除杂蛋白,用20mM、与250mM咪唑将目的蛋白洗脱下来并收集;HPLC响应峰较好条件下三种重组毒素使用流动相A和B比例:45%(1%三氟乙酸水溶液)和55%(60%的乙腈溶液)。2.重组蝎毒素抗痛多肽的抗痛效应及细胞机制通过行为学观察、膜片钳电生理记录,比较三种重组蝎毒素多肽的抗痛效应及细胞机制。采用膜片钳技术给大鼠DRG细胞上加入重组抗痛蝎毒素,记录其具有显著抑制钠电流的作用。在大鼠上测其镇痛效应,以1 mg/ml的剂量腹腔注射,发现大鼠有不同程度的疼痛缓解反应,通过大鼠对疼痛的抑制率来比较出各个毒素的镇痛作用大小。而这些差异可能与蝎毒素的序列、结构及其与钠通道互作相关。综上,蝎毒素是研究离子通道神经药理学的分子工具之一。本论文通过构建原核细胞外源表达系统,并优化出三种蝎毒素多肽的可溶性表达条件,实验证明这些蝎毒素多肽的具有的差异性抗痛活性。结果有助于推进蝎毒素天然状态低丰度表达、化学合成无活性、结构解析与改造等技术难题的解决,为进一步研究与疼痛相关膜离子通道结构与功能提供了一定的科学与技术基础。
  • 【期刊】 原核细胞microRNA特性及其作用机制研究进展

    刊名:中国人兽共患病学报 作者:张新蔚 ; 黄燕颖 ; 严杰 ; 孙爱华 关键词:原核细胞 ; 基因表达 ; 调控 ; 作用机制 机构:温州医科大学检验医学院 ; 温州医科大学检验医学院 ; 杭州医学院基础医学部 ; 浙江大学医学院病原生物学系 ; 杭州医学院基础医学部 年份:2017
    摘要:microRNA为一类非编码小RNA,主要通过其种子序列(seed sequence,SS)与靶mRNA位于5"端的SS结合序列特异性结合后抑制靶mRNA转录或降解靶mRNA,从而在转录后水平负调控靶基因表达.microRNA首先发现于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans),此后发现各种真核细胞均存在大量各种microRNA.真核细胞首先转录出microRNA前体,经剪切后成为21~23 nt有功能的microRNA,大多与靶mRNA的3"端序列结合后引起靶mRNA翻译抑制或降解.近年不少细菌等原核细胞microRNA被发现,但原核细胞microRNA不需剪切即有活性,大小为50~400 nt,其特性、作用位点和机制等也与真核细胞有一定差异.本文简要介绍真核和原核细胞基因表达调控主要机制、microRNA特点及其调控基因表达的机制,以期为深入研究原核细胞型病原微生物基因表达调控与致病机制奠定基础.
  • 【专利】 用于在原核细胞中重组生产多肽的方法

    作者:C·尚茨 年份:2014
    摘要:本申请公开用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法,其包括以下步骤:i)培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌,和ii)从细胞或培养基中回收多肽。
  • 【期刊】 两个大豆MYB转录因子在原核细胞中的高效表达

    刊名:生物技术通报 作者:李晓薇 ; 苏连泰 ; 赵旭 ; 翟莹 ; 张海军 ; 张庆林 ; 李景文 ; 王庆钰 关键词:大豆 ; MYB转录因子 ; 载体构建 ; pET-28a ; + ; Rosetta ; DE3 ; 原核表达 机构:吉林大学植物科学学院 ; 吉林大学植物科学学院 ; 吉林省产品质量监督检验院 年份:2011
    摘要:大豆(Glycine max)GmMYB12a与GmMYB12B2基因属于典型的植物R2R3-MYB转录因子。为进一步研究两个MYB12转录因子与相应顺式作用元件的相互作用,构建了两基因的原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中实现高效表达。利用PCR技术,将两端带有特异酶切位点的GmMYB12a与GmMYB12B2全长基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+),酶切、测序鉴定确认获得两基因的重组原核表达载体pET-28a-GmMYB12a与pET-28a-GmMYB12B2。然后把重组载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。结果表明,成功构建了两基因的原核表达载体,在IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导6 h后,目的蛋白能在Rosetta(DE3)中高效表达。
  • 【期刊】 融合蛋白人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原核细胞中的表达

    刊名:北京医学 作者:刘秀红 ; 李宁 ; 武彦宁 ; 赵焕英 ; 李莉 关键词:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 ; 基因表达 ; 融合蛋白 机构:首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫研究中心 ; 首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫研究中心 ; 首都医科大学附属北京佑安医院肝胆外科 ; 首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所 ; 首都医科大学附属北京佑安医院 ; 首都医科大学测试中心 ; 首都医科大学附属北京佑安医院性病艾滋病实验室 年份:2014
    摘要:目的构建人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)重组原核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因产物,与pMD-18 simple T载体进行连接构建出T克隆载体;从T载体上获取基因片段,并对pET-32a(+)空载体进行双酶切,用T4连接酶连接,构建出pET-32a(+)-GPC3原核表达载体;对构建好的载体再次测序,并进行诱导表达。结果 PCR产物长度为837 bp,即扩增的GPC3 C末端长度,与NCBI网站的相比较,序列完全一致,说明pET-32a(+)载体中正确插入了目的片段,并且诱导表达出蛋白。结论成功构建了融合表达Pet-GPC3载体,蛋白诱导表达成功。
  • 【专利】 一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法

    作者:许成钢 ; 王艺霖 ; 滕琳 ; 徐健 年份:2016
    摘要:本发明涉及基因表达调控和基因工程领域,具体说是一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法。在原核基因操作子结构的基础上,通过外源质粒引入核糖核酸内切酶特异性剪切位点和颈环结构的序列,来控制不同片段的稳定性,进而控制片段编码基因的转录水平。本发明能够实现体内不同基因特定比例的可控表达,为成功构建含有特定比例的多亚基复合体及多酶协同的代谢途径工程菌株提供了一个有效的合成生物学方法。
  • 【期刊】 B细胞连接蛋白在原核细胞中的表达和纯化

    刊名:生物技术通讯 作者:张志英 ; 肖斌 ; 蒋娟 ; 黄秀娜 ; 张蓉 ; 李晓 ; 刘娟子 ; 连菲 ; 杨永泉 ; 张莹莹 ; 孙朝晖 ; 李林海 关键词:B细胞连接蛋白 ; 原核表达 ; 纯化 机构:[1]中国人民解放军广州总医院 ; [1]中国人民解放军广州总医院 年份:2018
    摘要:目的:利用原核细胞体系表达并纯化B细胞连接蛋白(BLNK)。方法:构建pMAL-c5x-BLNK重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(Plyss),IPTG诱导BLNK融合蛋白的表达,通过MBP柱亲和纯化获得目标蛋白,进行12%SDSPAGE分析。结果:构建了BLNK的原核表达质粒pMAL-c5x-BLNK,该质粒在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为11℃的条件下,可以在大肠杆菌BL21(Plyss)中表达高纯度的BLNK。结论:在原核细胞表达体系中表达并制备了高纯度的BLNK,为下一步研究BLNK的相互作用蛋白和分子结构打下了基础。
  • 【期刊】 汉坦病毒S基因在原核细胞中高效表达的研究

    刊名:中国媒介生物学及控制杂志 作者:袁子国 ; 张秀香 ; 张守峰 ; 徐慧娟 ; 王晓虎 ; 扈荣良 关键词:原核细胞 ; 汉坦病毒 ; S基因 ; 表达 机构:军事医学科学院军事兽医研究所 ; 军事医学科学院军事兽医研究所 ; 军事医学科学院军事兽医研究所 ; 军事医学科学院军事兽医研究所 ; 军事医学科学院军事兽医研究所 ; 军事医学科学院军事兽医研究所 ; 军事医学科学院军事兽医研究所 ; 华南农业大学兽医学院 年份:2008
    摘要:目的通过基因工程的方法从鼠肺中扩增出汉坦病毒的S基因,并实现其蛋白的体外表达。方法应用RT-PCR方法扩增汉坦病毒汉城型(SEO)的YZG-Changchun株S基因,然后克隆到pMD18-T载体中,经序列分析后,定向克隆入原核表达载体pET-28a中,转化大肠埃希菌Rosetta用IPTG诱导表达后,将全菌裂解,用SDS-PAGE和Western-blot检测重组菌中外源蛋白的表达情况和免疫反应性的分析。结果S基因在原核细胞中得到了高效表达,表达的蛋白占菌体蛋白总量的37%,且具有良好的免疫反应性。结论汉坦病毒S基因蛋白可通过基因工程手段获得体外高效表达,这将对其功能的研究及为汉坦病毒疫苗的研究提供基础。
  • 【期刊】 原核细胞蛋白酶体调节亚基MecA-CIpC异六聚体结构与功能

    刊名:科学中国人 关键词:原核细胞 ; 蛋白酶体 ; 体结构 ; 功能 ; 亚基 ; 蛋白质水解 ; 生命体 ; ATP 年份:2011
    摘要:ATP依赖蛋白酶的可调控蛋白质水解广泛存在于大多数生命体中。细菌CIpC是CIp/Hsp100家族的重要成员,与该家族其它成员不同的是.
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