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  • 【期刊】 溶瘤病毒治疗与肿瘤微环境及机体免疫的关系

    刊名:肿瘤研究与临床 作者:刘滨磊 ; 曾贝贝 ; 张文 ; 刘尚梅 关键词:溶瘤病毒 ; 肿瘤微环境 ; 免疫疗法 机构:国家癌症中心 ; 国家癌症中心 ; 国家肿瘤临床医学研究中心 ; 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院病理科 ; 国家癌症中心 ; 国家肿瘤临床医学研究中心 ; 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院免疫实验室 ; 湖北工业大学生物医药研究院实验中心 年份:2018
    摘要:溶瘤病毒(OV)与肿瘤微环境及机体免疫系统间的关系对于抗肿瘤治疗效果至关重要.OV的抗瘤机制比较复杂,涉及了直接的细胞毒作用、肿瘤微环境免疫原性的改变、肿瘤血管的影响及诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应,继而杀伤已感染及未感染的肿瘤细胞,达到持续全身性的治疗效果.
  • 【期刊】 重组病毒法捕获宫颈癌循环肿瘤细胞的初步研究

    刊名:湖北科技学院学报(医学版) 作者:刘滨磊 ; 徐赐栋 ; 邹建文 ; 李军 ; 吴基良 ; 张开泰 ; 阎蓓 关键词:宫颈癌 ; 循环肿瘤细胞 ; 单纯疱疹病毒 机构:湖北科技学院药学院 ; 湖北科技学院药学院 ; 武汉滨会生物科技股份有限公司 ; 武汉大学附属同仁医院 ; 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院病因及癌变研究室 年份:2019
    摘要:目的构建新的含有表达绿色荧光蛋白(GFP)的单纯疱疹病毒(OHSV2-GFP),初步验证其对循环肿瘤细胞特异性示踪作用。方法采用PCR、分子克隆及同源重组技术,从HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5基因并插入GFP表达序列,构建OHSV2-GFP。抽取健康志愿者外周血4mL,将Hela细胞按10、100、500个加入外周血中后,按照MOI=1比例转染重组病毒OHSV2-GFP~+,然后用流式细胞仪进行该方法检出率测定;收集40例正常人、15例宫颈炎患者和20例宫颈癌患者外周血4mL,裂解去除红细胞后,按照MOI=1的比例转染重组病毒OHSV2-GFP~+,24h后收集细胞,流式细胞仪检测CD45~+/GFP~-细胞并计数,初步检测该方法临床应用的可行性。结果将Hela细胞按10、100、500个加入外周血中后,检测结果显示,检出数分别为6.3、61.7、300.5,总体检出率为61.7%,线性回归分析显示应用此方法捕获的CTC数量与预先加的肿瘤细胞数呈线性关系,R~2≥0.95。宫颈癌患者的GFP~+/CD45~-细胞数(10.90±2.3)个明显高于正常人(0.38±0.12)和宫颈炎患者(0.33±0.09)个,差异具有显著性(P<0.01)。结论本研究应用循环肿瘤细胞能够被该重组病毒捕获的特性,建立一种新的CTCs检测技术,并针对此技术的可靠性进行了证实,为进一步的临床应用研究打下了基础。
  • 【期刊】 重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒纯化工艺的建立

    刊名:中国生物制品学杂志 作者:刘滨磊 ; 吴振 ; 张紫怡 ; 汪洋 ; 胡翰 ; 石晓太 ; 毛泽勇 ; 方志正 关键词:重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒 ; 纯化 ; Capto~(TM) Core 700 机构:湖北工业大学 ; 湖北工业大学 ; 武汉滨会生物科技股份有限公司 年份:2018
    摘要:目的建立重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simple virus typeⅡ,o HSV2)OH2纯化工艺,制备高纯度的病毒。方法采用不同粗滤材质[PDH4囊式过滤器、Bio20囊式过滤器、Ultipor GF U6-40、PP材质滤膜(聚丙烯膜)和CA材质滤膜(醋酸纤维膜)]澄清过滤后,使用不同的层析柱(Mustang Q、Sartobind Q囊式离子交换柱和Capto~(TM) Core 700)进行纯化,并根据确定的纯化工艺,进一步放大层析柱体积。依据病毒滴度的变化,选择合适的纯化工艺条件。结果 PP及CA材质滤膜过滤病毒液后滴度变化较小,二者对病毒吸附较低;Mustang Q、Sartobind Q囊式离子交换柱纯化OH2病毒时收率最高为13%,而Capto~(TM) Core 700在AKTA仪上纯化高滴度的病毒液时几乎不损失病毒;使用Capto~(TM) Core 700进行柱体积放大后,柱床直径为26 mm时,纯化后病毒的滴度及收率较理想。结论使用CA膜过滤细胞裂解液后,采用Capto~(TM) Core 700进行柱层析,可制备高纯度的OH2。
  • 【会议】 细菌纳米磁小体为载体的基因疫苗研究

    作者:刘滨磊 ; 唐翌姝 ; 王冬梅 ; 周春霞 ; 马文博 ; 张玉倩 ; 张叔人 年份:2012
    摘要:目的:DNA疫苗是一种能激发抗原特异性免疫的方法。新型纳米材料细菌纳米磁小体(Bacterial Magnetic Particles,BMP)是趋磁性细菌体内合成的磁性纳米颗粒。BMP本身所特有的独特性质,使其在许多领域得到广泛的应用,但作为基因载体的研究很少。本研究应用基因疫苗p SLC-E7-Fc作为模型,优化了BMP作为载体的基因疫苗制备及其应用方法。方法:基因疫苗p SLC-E7-Fc是运用HPV-16E7作为免疫原基因,两边分别与次级淋巴组织趋化
  • 【期刊】 肿瘤微环境与炎症反应及溶瘤病毒治疗的关系

    刊名:中国肿瘤生物治疗杂志 作者:刘滨磊 ; 施桂兰 ; 张叔人 关键词:炎症反应 ; 肿瘤微环境 ; 溶瘤病毒 机构:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫研究室 ; 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫研究室 年份:2012
    摘要:炎症反应在清除病原体、创伤愈合和抗肿瘤免疫中发挥重要作用,被肿瘤细胞劫持的炎性细胞和细胞因子也是肿瘤微环境重要的参与者;许多肿瘤起源于感染和慢性炎症,肿瘤微环境中炎症细胞和炎症介质的蓄积具有促进恶性细胞增殖和存活、促进血管生成和肿瘤转移,以及逆转获得性免疫反应的作用,也改变了肿瘤细胞对激素和化疗药物的敏感性。炎症反应在肿瘤的发生和消除中发挥的作用比较复杂。溶瘤病毒治疗肿瘤,是充分利用溶瘤病毒选择性感染和杀伤肿瘤细胞的特性。在肿瘤微环境中,溶瘤病毒所诱导的针对肿瘤细胞和病毒的天然免疫反应具有双重效应:既能引起肿瘤细胞的损伤,促进溶瘤病毒抗肿瘤的疗效,也能识别、清除隐藏于肿瘤组织内部的溶瘤病毒,降低溶瘤病毒的效应。
  • 【期刊】 构建单纯疱疹病毒易感的鼠黑色素瘤细胞系B16RHSV

    刊名:中华肿瘤杂志 作者:刘滨磊 ; 庄秀芬 ; 周爱萍 ; 施桂兰 ; 韩香萍 ; 李洁 ; 张郁 ; 张友会 ; 张叔人 关键词:单纯疱疹病毒属 ; 黑色素瘤 ; 疱疹病毒侵入介体 ; 小鼠 机构:中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫室 ; 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫室 ; 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所内科 ; 南开大学生命科学学院 年份:2012
    摘要:目的 构建溶瘤性单纯疱疹病毒( oHSV)易感的C57/BL小鼠黑色素瘤细胞系B16RHSV,同时仍保留其在小鼠体内诱导肿瘤生长的能力.方法 以人黑色素瘤细胞系A375的基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出疱疹病毒侵入介体(HVEM),将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体中并测序.将测序正确的HVEM基因克隆入pcDNA3质粒载体,产生pcDNA3-HVEM.以pcDNA3-HVEM质粒载体转染C57/BL小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10,使用含有GG418的完全培养基筛选可能的阳性克隆,并通过免疫磁珠筛选出表达HVEM的细胞,命名为B16RHSV.用表达绿色荧光蛋白(GFP)的oHSV( oHSVGFP)与B16RHSV细胞体外共培养,观察细胞病变效应和GFP的表达情况.分别以相同剂最的B16-F10和B16RHSV细胞接种于C57/BL小鼠右侧背部皮下,观察这两种细胞诱导小鼠体内形成肿瘤的能力.结果 在荧光显微镜下可观察到B16RHSV细胞表达绿色荧光并出现细胞病变效应,证明B16RHSV细胞能够被oHSV感染并在细胞内繁殖,而其亲代细胞B16-F10则不能.B16RHSV和B16-F10细胞接种于小鼠5d后,两组小鼠均可观察到肿瘤生长,且肿瘤生长情况基本一致.用oHSVGFP治疗两种细胞的荷瘤鼠,仅在B16RHSV细胞荷瘤的小鼠体内显示出明显的溶瘤效应.结论 构建的B16RHSV是对oHSV易感、保持体内成瘤性的小鼠黑色素瘤细胞系.
  • 【期刊】 新型溶瘤病毒oHSV2hGM-CSF的构建及其抗肿瘤作用

    刊名:中华肿瘤杂志 作者:刘滨磊 ; 施桂兰 ; 庄秀芬 ; 韩香萍 ; 李洁 ; 张郁 ; 张叔人 关键词:溶瘤病毒 ; 疱疹病毒2型,人 ; 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 ; 肿瘤生物治疗 ; 合胞体 机构:中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫室 ; 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫室 年份:2012
    摘要:目的 构建表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的2型溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV2hGM-CSF),初步验证其体外溶瘤效果及其对小鼠B16R黑色素瘤模型的体内疗效.方法 采用PCR、分子克隆及同源重组技术,从HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5和ICP47基因,并插入hGM-CSF表达序列,构建oHSV2hGM-CSF.将HeLa、Eca-109和PG等16种肿瘤细胞分别接种到24孔板,用1型溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV1 hGM-CSF)或oHSV2hGM-CSF(感染复数=1)感染24、48 h后,显微镜下观察细胞病变.以表达HSV感染受体的C57 BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16R为动物模型,当肿瘤生长至7~8 mm3时,瘤内分别注射2.3×106 PFU的oHSV1hGM-GSF和oHSV2hGM-CSF,共3次,每次间隔3d,同时测量肿瘤大小,并观察生存期.结果 PCR检测和DNA序列分析结果证实,各目的基因已被剔除,hGM-CSF表达盒插入到ICP34.5的基因位点.oHSV1hGM-CSF和oHSV2hGM-CSF感染肿瘤细胞24h后,即能观察到细胞病变,目溶瘤谱较广,oHSV2hGM-CSF感染的肿瘤细胞合胞体现象多于oHSV1hGM-CSF感染者;感染48 h后,oHSV2hGM-CSF对HeLa、HepG2、SK-Mel-28、B16R、U87-MG细胞的溶瘤效果优于oHSV1hGM-CSF.动物实验显示,肿瘤接种后第15天,PBS组、oHSV1 hGM-CSF治疗组和oHSV2hGM-CSF治疗组小鼠的肿瘤体积分别为( 374.7±128.24) mm3、( 128.23±45.32) mm3和( 10.06±5.10) mm3,oHSV2hGM-CSF明显延缓了荷瘤小鼠肿瘤的生长.PBS组小鼠在接种B16R细胞22 d后全部死亡;oHSV1 hGM-CSF治疗组和oHSV2hGM-CSF治疗组小鼠在接种B16R细胞110 d时,存活率分别为60%和80%(P>0.05).与PBS组相比,oHSV1 hGM-CSF治疗组和oHSV2hGM-CSF治疗组小鼠的生存期明显延长(P<0.01).结论 oHSV2hGM-C-SF对人肿瘤细胞溶瘤谱较广,对荷B16R黑色素瘤瘤内注射有较好的抗肿瘤效应,具有较好的开发前景.
  • 【期刊】 溶瘤单纯疱疹病毒靶向治疗恶性肿瘤研究进展  

    刊名:《中国肿瘤》 作者:刘滨磊 ; 王飞飞 ; 张文 ; 关琦 ; 刘尚梅 关键词:恶性肿瘤 ; 单纯疱疹病毒 ; 靶向治疗 ; 生物治疗 机构:内蒙古民族大学 ; 内蒙古民族大学 ; 湖北工业大学 年份:2016
    摘要:单纯疱疹病毒是肿瘤生物治疗中常用的病毒载体之一,溶瘤单纯疱疹病毒以其溶瘤效率高、特异性好、可行性强成为近年来研究的热点。全文对这一领域的研究进展进行综述。
  • 【期刊】 重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰稳定性研究

    刊名:湖北科技学院学报(医学版) 作者:刘滨磊 ; 孙美玲 ; 邹建文 ; 徐赐栋 ; 吴基良 ; 李炎坤 关键词:型别鉴定 ; 基因修饰 机构:湖北科技学院药学院 ; 湖北科技学院药学院 ; 武汉滨会生物科技股份有限公司 年份:2017
    摘要:目的 探讨重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰的稳定性.方法 型别鉴定实验根据I型(HSV-1)及II型(HSV-2)单纯疱疹病毒gD糖蛋白基因的保守序列设计引物进行PCR扩增,HSV-1 PCR片段上有一个MspI酶切位点,经酶切及电泳实验鉴别OH2病毒的型别;基因修饰实验根据被敲除或插入的序列位点上下游病毒核酸序列设计引物进行PCR扩增及电泳,并用电泳图分析OH2病毒基因组中是否剔除ICP34.5基因、ICP47基因及插入hGM-CSF基因;ELISA检测OH2上清中hGM-CSF含量验证插入的hGM-CSF基因能否正常表达.结果 型别鉴定实验中HSV-1经酶切实验出现130bp和70bp两条条带,而HSV-2和OH2病毒PCR条带和酶切条带均只有一条,且为200bp.基因修饰实验中OH2病毒在四对引物下扩增,能扩增出对应大小的条带.ELISA实验中hGM-CSF浓度在31.25~500pg/mL范围内线性关系良好,且OH2病毒中hGM-CSF表达量均大于2ng/mL.结论 OH2病毒中被修饰的基因稳定地存在,同时插入的hGM-CSF基因能够正常表达.
  • 【期刊】 人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(OH2)生物学特性的稳定性

    刊名:中国生物制品学杂志 作者:刘滨磊 ; 李延飞 ; 毛泽勇 ; 石晓太 ; 邹建文 ; 董玉婷 ; 孙美玲 ; 方志正 关键词:人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型 ; 生物学特性 ; 稳定性 机构:湖北科技学院武汉滨会生物科技股份有限公司 ; 湖北科技学院武汉滨会生物科技股份有限公司 年份:2016
    摘要:目的分析人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)生物学特性的稳定性。方法将OH2在Vero细胞中连续传20代,测定不同时间点收获的不同代次(P4、P10、P20)病毒的滴度,并绘制病毒的生长曲线;ELISA夹心法检测表达的h GM-CSF的含量;TF-1细胞培养法检测表达的h GM-CSF的活性;CCK-8试剂盒检测OH2的体外癌细胞杀伤能力。结果 OH2在Vero细胞中连续传20代后,不同代次病毒(P4、P10、P20)的生长曲线模式、表达的h GM-CSF含量及活性、体外癌细胞的杀伤能力均无明显差异。结论 OH2生物学特性的稳定性良好,具有新生物药开发前景。
  • 【期刊】 人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(OH2)生物学特性的稳定性

    刊名:《中国生物制品学杂志》 作者:刘滨磊 ; 李延飞 ; 毛泽勇 ; 石晓太 ; 邹建文 ; 董玉婷 ; 孙美玲 ; 方志正 关键词:人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型 ; 生物学特性 ; 稳定性 机构:湖北科技学院 ; 湖北科技学院 ; 武汉滨会生物科技股份有限公司 年份:2016
    摘要:目的分析人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)生物学特性的稳定性。方法将OH2在Vero细胞中连续传20代,测定不同时间点收获的不同代次(P4、P10、P20)病毒的滴度,并绘制病毒的生长曲线;ELISA夹心法检测表达的h GM-CSF的含量;TF-1细胞培养法检测表达的h GM-CSF的活性;CCK-8试剂盒检测OH2的体外癌细胞杀伤能力。结果 OH2在Vero细胞中连续传20代后,不同代次病毒(P4、P10、P20)的生长曲线模式、表达的h GM-CSF含量及活性、体外癌细胞的杀伤能力均无明显差异。结论 OH2生物学特性的稳定性良好,具有新生物药开发前景。
  • 【期刊】 oHSV1-GFP法检测肝癌循环肿瘤细胞

    刊名:中国组织化学与细胞化学杂志 作者:刘滨磊 ; 阴丽媛 ; 张文 ; 肖汀 ; 荣维淇 ; 王云 ; 韩迺君 ; 邸雪冰 ; 郭素萍 ; 张开泰 ; 程书钧 关键词:循环肿瘤细胞 ; 单纯疱疹病毒 ; 转移 ; 人端粒酶逆转录酶 机构:北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院病因及癌变研究室 ; 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院病因及癌变研究室 ; 中国医学科学院肿瘤医院免疫学研究室 ; 中国医学科学院肿瘤医院腹部外科 年份:2015
    摘要:目的循环肿瘤细胞在肿瘤转移诊断、个体化治疗/疗效评估及肿瘤转移机制研究等方面具有重要价值,然而由于其在循环系统中比例极低,循环肿瘤细胞的分离和鉴定成为临床应用的难点。oHSV1-GFP是一种经过基因修饰的人单纯疱疹病毒。我们将该病毒的复制关键基因ICP4的启动子替换为人端粒酶逆转录酶的启动子,并在ICP4下游连接GFP表达盒,以使该病毒在感染细胞后,能在端粒酶逆转录酶转录环境的作用下激活下游绿色荧光蛋白的表达基因。本研究旨在利用该病毒捕获循环肿瘤细胞,从而建立一种简便重复性好灵敏度高的检测方法,并对该检测方法的可靠性及临床应用价值进行探讨。方法 Western blot技术检测肿瘤细胞系、肿瘤组织及正常细胞中端粒酶逆转录酶表达情况;抽取正常健康人外周血4ml,将肿瘤细胞系分别按一定梯度加到外周血中,按照MOI=1比例转染重组病毒oHSV1-GFP DNA,流式细胞仪检测CD45-/GFP+细胞数,进行该方法检出率的测定;收集临床标本外周血4ml,裂解去除红细胞后,按照MOI=1比例转染重组病毒oHSV1-GFP DNA,24h后收集细胞,流式细胞仪检测CD45-/GFP+细胞并计数,初步检测该方法临床应用的可行性。结果 Western blot检测结果显示肿瘤细胞系及肿瘤组织呈现端粒酶逆转录酶高表达状态,而正常细胞中端粒酶逆转录酶表达量低。在该检测方法中,我们将CD45-/GFP+细胞定义为循环肿瘤细胞。检出率测定结果显示:外周血中加入SMMC7721细胞10,50,100(个)的检出数分别为6.8±2.04,40.8±4.04,85.9±7.03,总体检出率为87.9%,外周血中加入Huh7细胞10,50,100(个)的检出数分别为6.6±1.90,39.8±3.88,86.4±7.63,总体检出率为88.5%。线性回归分析显示该方法捕获的细胞数与实际肿瘤细胞数呈明显相关性,r2>0.95。应用该方法检测26例肝癌患者及50例正常健康人外周血显示,肝癌患者外周血中CD45-/GFP+的细胞数(16.7±2.77)明显高于正常健康人(0.94±0.12)P<0.0001,亚组分析显示区域淋巴结阳性的患者外周血中循环肿瘤细胞计数(23.77±4.49)明显高于区域淋巴结(9.76±1.87)的患者,P=0.0002。结论本研究建立了一种新型循环肿瘤细胞检测方法,并对该方法的可靠性及临床应用价值进行了评估。该方法能够特异性示踪循环肿瘤细胞,具有潜在临床应用价值。
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