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  • 【期刊】 大头金蝇β-actin基因克隆与多克隆抗体制备

    刊名:环境昆虫学报 作者:张敏 ; 张古忍 关键词:大头金蝇 ; Β-ACTIN ; 基因克隆 ; 抗原多肽 ; Western ; BLOT 机构:[1]南华大学生物化学与分子生物学教研室 ; [1]南华大学生物化学与分子生物学教研室 ; [2]中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室 年份:2018
    摘要:为深入研究大头金蝇Chrysomya megacephala(Fabricius)关键功能基因的表达调控,运用RT-PCR和RACE技术,克隆获得大头金蝇β-actin基因cDNA全长序列(GenBank登录号为KC207081),并对其进行生物信息学分析。大头金蝇β-actin基因cDNA全长1 355 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 131 bp,编码376个氨基酸,5'UTR长度为87 bp,3'UTR约为110 bp。ORF编码的蛋白质分子量为41.8 D,等电点5.286,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达97%-99%,且含有由6个β-actin蛋白家族特有的保守模式(motif)所构成的指纹。根据对β-actin氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可及性分析预测,设计并合成β-actin抗原多肽(CysGPYARVKRHQKGLKT),免疫新西兰兔获得多克隆抗体,其效价远高于1∶64 000。采用Western Blot技术检测大头金蝇各发育阶段的β-actin蛋白表达,结果表明β-actin表达恒定。本文的研究结果为大头金蝇功能基因的深入研究提供了坚实的基础。
  • 【期刊】 鸡Hsp60基因的克隆表达及多克隆抗体制备

    刊名:中国家禽 作者:武琥琮 ; 倪杰 ; 谢菁 ; 李拓凡 ; 吕璐 ; 任丹 ; 秦爱建 ; 叶建强 关键词:Hsp60 ; ; 多克隆抗体 机构:扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点试验室江苏省动物预防医学重点试验室 ; 扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点试验室江苏省动物预防医学重点试验室 ; 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 ; 扬州大学农业科技发展研究院 ; 教育部农业与农产品安全国际合作联合试验室 年份:2018
    摘要:研究对鸡Hsp60基因进行了扩增以及原核与真核表达载体构建。构建的原核表达载体GST-HSP60经IPTG诱导,SDS-PAGE分析获得了Hsp60的融合表达蛋白。采用纯化的GST-HSP60蛋白免疫小鼠制备抗Hsp60多克隆抗体。Western blot以及间接免疫荧光分析证明,所制备的抗Hsp60多克隆抗体不仅能识别转染真核表达载体pcDNA3.1-Hsp60表达的外源性鸡源Hsp60蛋白,而且能有效识别内源性鸡源以及人源的Hsp60蛋白。这些Hsp60基因表达载体的构建以及抗Hsp60蛋白特异性多克隆抗体的制备为进一步研究Hsp60生物学功能及其在家禽疫病中的潜在作用奠定了基础。
  • 【期刊】 猪ISG15基因的克隆表达与多克隆抗体的制备

    刊名:中国兽医科学 作者:李双双 ; 李新果 ; 石昂 ; 时庆贺 ; 杨利 ; 王玉国 ; 陈陆 ; 李永涛 ; 王川庆 关键词: ; ISG15基因 ; 蛋白表达 ; 多克隆抗体 机构:河南农业大学牧医工程学院 ; 河南农业大学牧医工程学院 年份:2017
    摘要:本研究从家猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出家猪ISG 15基因,经测序和序列分析,将ISG 15片段与p ET28a质粒连接,构建重组原核表达载体p ET28a-ISG15;经IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,以获得ISG15蛋白。用纯化的ISG15蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果显示,家猪ISG 15基因CD S区长504 bp,编码167个氨基酸,包括两个泛素样结构域(N端第3~75位和C端第81~156位氨基酸肽段)及C末端保守序列为LRLRGG;W estern-blot分析表明重组ISG15蛋白的免疫原性良好;经ELISA测定血清中抗体的效价为1∶102 400。上述研究结果为进一步揭示家猪ISG15蛋白的功能奠定了基础。
  • 【期刊】 鸽Beclin 1基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

    刊名:中国家禽 作者:李铭 ; 张志国 ; 胡敏 ; 张奕婷 ; 刘爽 关键词:王鸽 ; Beclin 1 ; 基因克隆 ; 原核表达 ; 多克隆抗体 机构:大庆师范学院生物工程学院 ; 大庆师范学院生物工程学院 ; 福瑞邦集团 年份:2018
    摘要:为了更好地理解自噬与禽类某些疾病的发生关系,研究制备了自噬重要标志性蛋白Beclin 1的多克隆抗体。首先克隆了鸽Beclin 1基因的部分保守序列,运用基因重组方法构建了pET52b-beclin 1原核表达载体,IPTG诱导后得到重组表达蛋白,采用镍柱纯化法得到目标蛋白。SDS-PAGE结果显示,所得到的目标蛋白分子量与预测值一致,表明纯化得到了高纯度目标蛋白。以目标蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,5免后制备抗血清。ELISA结果显示效价为1∶20 000,Western blot显示抗体具有良好的特异性。结果为检测自噬相关禽类疾病的发生中Beclin 1基因的蛋白表达提供了必要的抗体基础。
  • 【期刊】 抗人AEG-1单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析

    刊名:中国生物工程杂志 作者:龙敏 ; 董柯 ; 王希 ; 陈曦 ; 刘冲 ; 刘丽 ; 张惠中 关键词:克隆 ; AEG-1 ; McAb ; 可变区基因 机构:第四军医大学唐都医院 ; 第四军医大学唐都医院 年份:2014
    摘要:AEG-1基因位于人染色体8q22,编码582个氨基酸,参与多种信号转导途径并与多种恶性肿瘤的发生、发展及生物学表型密切相关。为更好地探讨AEG-1生物学功能,以纯化的p GSTag-AEG-1蛋白免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术并经筛选及鉴定,获得了分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1 E3;Western blot及免疫组化证实该细胞株分泌的单克隆抗体能与肿瘤细胞中AEG-1蛋白特异性结合;RT-PCR方法从1E3细胞中克隆出抗AEG-1抗体的VH和VL基因片段,通过测序分析、碱基和蛋白序列的比对确认该株抗体为鼠源性Ig G的轻、重链可变区基因。进一步运用Kabat System在线分析系统对VH和VL基因进行结构分析,确证FWRs和CDRs的结构完整,VH编码117个氨基酸;VL编码119个氨基酸,属于轻链κV家族。实验结果为进一步研究AEG-1与恶性肿瘤发生、发展的关系及在其临床诊断中的应用奠定了基础。
  • 【期刊】 猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

    刊名:西北农林科技大学学报(自然科学版) 作者:刘伟 ; 郭抗抗 ; 林鸷 ; 盛洁 ; 赵娣 ; 赵紫印 ; 张彦明 关键词:猪Jiv蛋白 ; 原核表达 ; 多克隆抗体 ; 猪瘟病毒 机构:西北农林科技大学动物医学院 ; 西北农林科技大学动物医学院 年份:2015
    摘要:【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。
  • 【期刊】 细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率的比较

    刊名:青海医学院学报 作者:刘燕 ; 朱吉海 ; 孙伟 ; 赵珺 关键词:混克隆细胞 ; 单克隆细胞 ; 干扰效率 机构:青海大学医学院免疫学教研室 ; 青海大学医学院免疫学教研室 ; 青海大学附属医院心胸外科 年份:2016
    摘要:目的 比较细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率.方法 采用胃泌素特异干扰载体转染人胃癌原代细胞株L25,经G418抗性筛选获得混克隆和单克隆细胞,应用RT-PCR、Western blot和免疫荧光三种方法对混克隆细胞和单克隆细胞干扰胃泌素基因的效率进行比较.结果 RT-PCR结果显示混克隆细胞胃泌素mRNA表达水平被明显抑制.在挑取的10株单克隆细胞中,胃泌素的表达均受到干扰,其效果有差异,其中有2株单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10胃泌素mRNA表达水平抑制率达到86%,抑制效率与混克隆细胞相同,其他8株单克隆细胞的平均抑制率为31%.Western blot和免疫荧光结果均显示单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10与混克隆细胞在胃泌素蛋白水平的干扰效果相同.结论 采用混克隆细胞进行生物学特性鉴定和后续基因表达水平研究,实验信息量大、周期短、污染几率小、可重复性强,是一种省时、简便、高效的方法.
  • 【期刊】 全球最大克隆工厂将在津开工 生产高端克隆牛肉

    刊名:《吉林畜牧兽医》 关键词:克隆 ; 工厂 ; 生产 ; 牛肉 ; 牛胚胎 ; 产业化 ; 中国 ; 犬类 年份:2016
    摘要:在不远的将来,中国将会出现一家据称是全球最大的克隆工厂。博雅控股集团表示,今年上半年,旗下的克隆工厂就将在天津投入生产,按照公开的计划,一期将主要用于生产10万头克隆牛胚胎,用于填补中国高端牛肉市场空缺;随后,包括工作犬类、顸级赛马等优质物种复制也将逐步落地产业化。
  • 【期刊】 筛选及鉴定IgG型单克隆抗-D噬菌体克隆的实验研究

    刊名:中国输血杂志 作者:吴凡 ; 庄乃保 ; 张印则 ; 苏宇清 ; 梁延连 关键词:肽库 ; RHD抗原 ; 细菌噬菌体 ; 表位 机构:深圳市血液中心 ; 深圳市血液中心 年份:2017
    摘要:目的利用随机噬菌体12肽库筛选出血型D抗原的模拟多肽并验证。方法采用Ig G型单克隆抗-D筛选噬菌体随机12肽库,测定每轮筛选后洗脱物与抗-Rh D的结合情况。对经特异性筛选得到的阳性噬菌体克隆进行DNA序列测定,将推导出的12肽氨基酸序列进行同源性比较,通过凝集抑制试验验证阳性噬菌体与Ig G型单克隆抗-D的反应。结果随着筛选轮次增加,噬菌体洗脱物与抗-Rh D的结合力逐渐增强。经过4轮淘洗后,得到8个亲和力较强且具有较高重合率的保守区域的12肽序列。凝集抑制实验表明具有相同氨基酸序列的阳性噬菌体对Ig G型单克隆抗-D与Rh D阳性红细胞的凝集反应具有抑制作用。结论随机噬菌体12肽库筛选得到的血型D抗原模拟多肽,为Rh D结构与功能研究及研制针对Rh D新生儿溶血病的新型诊断抗原、制备特异疫苗以及探索新的治疗方法提供实验基础。
  • 【期刊】 关中黑猪IL-5 cDNA的克隆表达与多克隆抗体制备

    刊名:细胞与分子免疫学杂志 作者:穆杨 ; 刘园园 ; 李亮亮 ; 刘阳 ; 尚川川 ; 周恩民 关键词: ; IL-5 ; 表达 ; 多克隆抗体 ; ELISA 机构:西北农林科技大学动物医学院 ; 西北农林科技大学动物医学院 ; 西北农林科技大学兽医免疫生物学研究所 年份:2013
    摘要:目的克隆关中黑猪IL-5 cDNA,构建该基因的不同表达质粒,获得表达的IL-5并制备其多克隆抗体。方法提取佛波酯(PHA)刺激的关中黑猪外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR克隆猪IL-5基因(sIL-5),鉴定后将sIL-5基因分别克隆到pQE30、pET-32a和pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pQE-sIL-5和pET-sIL-5及pEGFP-sIL-5,将pEGFP-sIL-5瞬时转染PK-15细胞,将pQE-sIL-5和pET-sIL-5分别转化JM109和BL21,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot法鉴定表达蛋白后,通过镍柱纯化目的蛋白。用纯化的BL21表达的IL-5免疫小鼠,制备其多克隆抗体,用纯化的JM109表达的IL-5通过优化的间接ELISA检测抗体效价。结果成功获得关中黑猪的IL-5基因(登录号KC660157),大小405 bp,与GenBank中猪IL-5参考序列同源性99.75%,仅25位的T变成C,但编码的氨基酸完全相同;荧光显微镜观察发现pEGFP-sIL-5在PK-15细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示JM109表达的目的蛋白的相对分子质量(M_r)约15 000,而BL21表达的目的蛋白M_r约30000,Western blot法检测结果表明,表达的目的蛋白均具有良好的反应原性;免疫小鼠后获得了IL-5的多克隆抗体,抗体效价最高可达1:12 800。结论克隆了关中黑猪IL-5基因片段并成功表达,获得了IL-5的多克隆抗体。
  • 【期刊】 多疣壁虎tubulin beta3基因克隆和多克隆抗体制备

    刊名:动物学研究 作者:李静 ; 秦勇 ; 顾云 ; 刘炎 ; 刘梅 关键词:多疣壁虎 ; Tubulin beta3 ; 分子克隆 ; 多克隆抗体 机构:南通大学 ; 南通大学 ; 江苏省神经再生重点实验室 ; 浙江省湖州市中心医院中心实验室 年份:2012
    摘要:Tubulin beta3(TUBB3)是特异表达于神经元的微管蛋白tubulin beta家族成员,被认为在维持轴突正常状态起着重要作用,是神经元特异的标志蛋白。该研究旨在获得多疣壁虎TUBB3全长cDNA序列并制备其多克隆抗体,为进一步研究多疣壁虎断尾再生提供基因和抗体工具。根据多疣壁虎中枢神经组织cDNA文库中TUBB3的EST片段序列,采用RACE-PCR方法,获得了全长cDNA,序列全长1790bp,编码450个氨基酸,与其他物种TUBB3蛋白高度同源;RT-PCR方法和Northern blotting检测了TUBB3组织表达谱及其转录本的大小;在GenBank登录号为JQ080315;NJ法构建的系统进化树分析表明,多疣壁虎的TUBB3蛋白与鸡的TUBB3蛋白在进化距离上较近;构建pET-32a-TUBB3原核表达载体,诱导表达并纯化TUBB3蛋白,获得兔抗壁虎TUBB3多克隆抗体,ELISA检测其效价大于1:65536,Western blotting方法证实所制备的多克隆抗体可特异识别多疣壁虎神经组织的的TUBB3蛋白。
  • 【期刊】 猪FcRn胞浆尾区的克隆表达及多克隆抗体制备

    刊名:中国兽医学报 作者:崔惠娟 ; 洪素梅 ; 陈志虎 ; 毕丁仁 ; 李自力 关键词: ; FcRn胞浆尾区 ; 原核表达 ; 多克隆抗体 机构:华中农业大学动物医学学院 ; 华中农业大学动物医学学院 ; 农业微生物学国家重点实验室 年份:2012
    摘要:采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区(FcRn-CT),构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层析柱纯化目的蛋白。用纯化蛋白KG-CT免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。利用纯化蛋白pET32a-CT建立了间接ELISA法,检测多抗效价达1∶32 000。Western blot检测结果表明该多抗特异性良好,为进一步研究FcRn在猪体内的表达分布及功能研究奠定了基础。